羟基酪醇的制备及药理作用

背景及概述^[1][2]

羟基酪醇( hydroxytyrosol，HT)是一种存在于油橄榄(Olea europaea L．) 植物中的多酚类化合物， 可从橄榄油、加工橄榄油废水以及橄榄叶中分离得到。前期诸多研究表明: 羟基酪醇清除自由基能力强，表现出独特的生物活性，如抗氧化、抗菌、抗炎、改善心脏的冠脉血流等， 而且还能抑制人类早幼细胞白血病细胞HL60、腺癌细胞 HT29 及 HT29 克隆体 19A、女性乳腺癌 MCF-7 细胞等扩散，通过阻滞肿瘤细胞的循环及诱发其凋亡，得到很好的抗癌活性。近年发现，羟基酪醇能够与 gp41 蛋白结合，阻断人免疫缺陷病毒(HIV) 进入宿主细胞， 或可用于艾滋病的防治。该化合物无明显毒性反应，其在医药、食品和化妆品行业的应用前景近年受到广泛关注。

热稳定性^[1]

利用热重分析仪对羟基酪醇热失重过程进行记录，图1为升温速率10 K /min 的 TG-DTG 曲线。从图 1 可看出，羟基酪醇的分解一步完成，260℃以前为稳定阶段，TG 曲线和 DTG 曲线一直都平滑无降低，说明在此之前羟基酪醇一直处于稳定状态而未分解。260℃ 之后，羟基酪醇开始剧烈分解，TG 曲线随着温度升高而迅速出现陡峭明显的失重台阶，DTG 曲线出现负值，且随着温度升高而急剧下降，在 305.2℃达到了DTG 的峰值，此时热失重速率为-12.91% /min。由图可以看出热分解在260～409℃ 为羟基酪醇主要失重阶段，其分解作用基本完成；在409～900 ℃为缓慢失重过程，且由羟基酪醇的 TG曲线可知此时其残留质量为2.68%。而 TG-DTG 曲线在409～900℃ 的升温过程中一直呈平滑曲线，说明此时的羟基酪醇已经分解完成。因此要保持羟基酪醇不分解，应保证外界温度不能超过260℃。

表 1 列出了不同升温速率下羟基酪醇热解特性参数， 同时也可看出升温速率的变化对羟基酪醇的分解有影响。随着升温速率提高，热失重的起始温度( t_b) 、 终止温度(t_e) 和热失重速率温度(t_m)均向高温区移动，且热分解程度也加剧。对羟基酪醇的T_m ( T_m = t_m + 273.15) 和不同β的变化情况进行线性拟合，可得到相关关系式。羟基酪醇热失重速率温度和升温速率的的关系式 T_m = 1.3657β+ 560.87，相关系数 R² =0. 9818。可见T_m 与β有很好的线性关系，且羟基酪醇在β= 0 K /min、N₂气氛中的平衡热分解温度为560. 87 K。

制备^[2]

羟基酪醇可通过酶或酸催化水解，从生产橄榄油的废料中提取得到，也可经化学合成制备，但规模化生产的方法尚不成熟。在化学合成方面，迄今报道的合成方法多是在实验室条件下完成的，例如，通过还原 3，4-二羟基苯乙酸可得到羟基酪醇，也可采用生物催化或化学方法将酪醇或苯乙醇转化为羟基酪醇， 但受到原料及反应条件的限制，仅适于实验室少量制作。羟基酪醇的经济、简便制备方法，目前仍是多方研究的课题。邻苯二酚价廉易得，是较好的合成原料，帝斯曼公司报道以邻苯二酚、乙醛酸为原料合成羟基酪醇的专利方法，二者在碱性条件下反应得到 3，4-二羟基扁桃酸，经高压催化氢化脱除羟基，再还原羧基得到羟基酪醇。此法步骤短，较适合进行工业生产，但脱除3，4-二羟基扁桃酸 α-羟基的反应，需在强酸和高压下完成，对设备要求较高，且收率较低。笔者尝试用亚硫酸氢钠或焦亚硫酸钠脱除3，4-二羟基扁桃酸的α-羟基，在较温和的条件下即可得到目标产物，二者效果相近。改进后的合成方法所用试剂价廉易得，反应条件简单易行，有利于羟基酪醇的规模化制备。

羟基酪醇的合成步骤如图 1 所示。邻苯二酚与乙醛酸在碱性环境和 Al₂O₃催化下缩合得到 3，4-二羟基扁桃酸(1) 。反应完成后体系中存在乙醛酸在碱性条件下发生歧化反应产生的杂质和未反应的邻苯二酚。文献中后处理方法是用有机溶剂萃取后，以饱和氯化铵洗涤有机相。该方法洗涤时易析出氯化铵固体，且有机相中也残留有氯化铵，影响实验操作和产物纯度。因此改用分级萃取的方法，首先用盐酸调溶液 pH 至 3～ 4，用乙酸乙酯萃取出未反应的邻苯二酚，而 3，4-二羟基扁桃酸仍在水层中；然后调 pH 至略小于 2，此时 3，4-二羟基扁桃酸易溶入有机相而被萃取出来， 蒸干后用乙醚洗涤可以得到较纯的产物。脱除 3，4-二羟基扁桃酸 α-羟基的现有方法， 是在高浓度盐酸和 Pd/C 催化下进行高压氢化，对设备要求苛刻， 实用性较差。经实验，将 3，4-二羟基扁桃酸在甲酸存在下与亚硫酸氢钠或焦亚硫酸钠反应，可脱除其α-羟基，得到3，4-二羟基苯乙酸(2)，两种试剂的脱羟基效果相近。升高浴温、延长反应时间可提高反应的产率。3，4-二羟基苯乙酸可直接还原得到羟基酪醇，但需要较强烈的还原反应条件。由于羟基酪醇温度过高时不稳定，因此本研究中首先将 3，4-二羟基苯乙酸甲酯(3) 化，再用LiAlH₄ 在 40℃将其还原成羟基酪醇(4)，两步反应总收率 85% 。

药理作用^[3]

1 抗癌作用研究

 HT 能抑制肿瘤发生的多个阶段且具有广谱性。首先，HT 能保护细胞内 DNA 和酶免受 ROS 与自由基的破坏以预防癌症的发生。与其酯化物橄榄苦苷相比，HT 具有更强的抗氧化应激作用，Ilavarsi 等证实在外周血单核细胞中 HT 降低了二噁英诱导的氧化应激和 DNA 破坏，它通过降低过氧化脂质、 ROS 的量和增加抗氧化酶的活性，抑制细胞内 DNA 被破坏，并减少细胞形态学的变化。另外，HT 在较低浓度下即能抑制丙二醛、H₂O₂脂肪酸和7-酮基胆固醇的生成，并能有效地阻断 ERK 和 Akt /Pkb 的磷酸化状态发生改变，还能抑制外来因素(如紫外线 B、苯胼芘等) 所导致的 DNA 破坏。其次，HT 能抑制癌细胞增殖与促进其凋亡来发挥抗癌作用。

2 抗血栓、调血脂和抗动脉硬化作用研究

研究发现食用橄榄油能大大降低心血管疾病的发病率，其中 HT 发挥了重要的作用。有研究指出，HT 抗心血管疾病的作用与抑制血小板凝集密切相关，González-Correa 等以水杨酸作参比考察了 HT 对大鼠体外血的抗凝集作用，实验结果证明它能抑制血栓素 B 的合成，并能提高氧化亚氮的生成量，从而达到抗凝作用。de Roos 等则以人血细胞为研究对象考察了 HT 的抗凝集作用，当浓度为 100 mg/L 时，蛋白质组学研究表明它参与调节 9 种蛋白发挥抗凝集作用，如血小板结构、活性和整合素 aIIb/b3 的转导等。由结果可知，HT 能抑制血小板的活性和粘连，可用于预防血栓的形成。

3 抗病原微生物作用研究

HT 可能开发成一种治疗肠道和呼吸道感染的药物，它具有高效和广谱的特点。以幽门螺旋杆菌为例，其在世界范围内存在多种耐抗生素的菌株，但是 HT对耐药和非耐药菌株均具有强力的杀伤作用。另有研究 HT 对 5 种标准菌株( ATCC 9006、ATCC 8176、ATCC 6539、ATCC 17802、ATCC 25923) 和临床上得到的 44 种菌株最低抑菌浓度分别为0．24～7．85 μg /mL、0．97～31．25 μg /mL，抑菌浓度明显低于其他植物提取物，而且对抑制革兰阳性菌的活性高于革兰阴性菌。值得注意的是，其抗菌活性不仅表现在肠道内有害菌种方面， 还 对嗜乳酸菌和双歧杆菌具有抑制作用。

主要参考资料

[1]原姣姣,叶建中,王成章,刘玉红.羟基酪醇的热稳定性和分解动力学研究[J].林产化学与工业,2016,36(06):87-92.

[2]肖艳,张杨,杨郁,任凤霞,崔广智,赵毅民.羟基酪醇的合成方法[J].国际药学研究杂志,2013,40(03):335-337.

[3]刘威振,张兴,陈新建,谭毓治.羟基酪醇药理作用研究进展[J].广东药学院学报,2012,28(06):684-688.