小鼠雪旺细胞的应用

背景^[1-3]

小鼠雪旺细胞是原代培养的小鼠雪旺细胞经长时间培养后自发转化而成的。2002年十二月提交到ATCC的培养物污染了支原体。其后代通过BM细胞周期蛋白处理21天消除支原体。处理后六周，用Hoechst染色、PCR和标准培养测试进行支原体检测，结果都呈阴性。

雪旺细胞沿神经元的突起分布，包裹在神经纤维上，雪旺细胞的外表面有基膜，能分泌神经营养因子，促进受损的神经元的存活及其轴突的再生，参与周围神经系统中神经纤维的构成。研究表明，神经元延伸时对与其接触的底物是非常具有选择性的，而且一旦与雪旺细胞接触，神经纤维的延伸就会严格限制在Bungner带内。

小鼠雪旺细胞

雪旺细胞是神经嵴的衍生物，形成周围神经髓磷脂轴突的髓鞘。它们分别环绕在周围神经轴突的轴上，沿着轴突节形成一层髓磷脂髓鞘。雪旺细胞对周围神经的发育，功能和再生起着重要作用。当轴突快死亡时，雪旺细胞环绕其周围帮助消化轴突。留下连续的雪旺细胞形成一个空的管道，新的轴突在管道的末端开始生长。在周围神经中雪旺细胞的数量是受到严格调控的。

体外增殖受到诸如PDGF，FGF，神经元和其它多肽类生长因子的刺激。雪旺细胞提供相对简单，明确，易得的哺乳动物模型以用来研究一系列发育问题。了解血旺细胞的生物学特征具有重要的临床意义，不仅对于研究神经病变产生的环境和神经的再生，而且细胞或他们的前体可能特别适合用作中枢神经系统修复的植入物。

应用^[4][5]

用于成年小鼠坐骨神经雪旺细胞体外培养的实验研究

加入了雪旺细胞生长所需要的生长因子（forskolin、heregulin-β-1、碱性成纤维细胞生长因子）以期模拟体内实验的效果。

方法：1.实验动物：绿色荧光蛋白（GFP）转基因小鼠。c57小鼠,雌雄不限。

2. 体外预变性：小鼠颈椎脱臼处死,分离切取坐骨神经,放于含有DMEM.DMEM+10%FBS、SCCM培养液中培养,1周后待检。体内预变性：小鼠10%戊巴比妥腹腔注射麻醉,暴露右侧坐骨神经,在远离脊神经根部切断坐骨神经,并使断端游离。术后1、2、3周取材待检。

3. 细胞培养及冰冻切片制作：分别将不同培养液中培养的及新鲜的坐骨神经组织漂洗,切碎,消化酶溶解,接种培养,传代。48小时后对SCCM组细胞进行纯化并做冰冻切片。

4. 组织和细胞免疫荧光检测：取各组的冰冻切片及培养的原代细胞行兔抗S100β及p75NTR免疫荧光染色。激光共聚焦显微镜观察组织切片中绿色荧光蛋白及S100p表达情况,普通荧光显微镜下观察细胞染色情况,随机选取5个视野计算细胞纯度。

5. 激光共聚焦下观察拍照。

6. 统计学处理：所有计数值以均数±标准差（x±s）表示,应用SPSS17.0统计软件进行数据分析。组间均数比较单因素方差分析（One-Way ANOVA）,多重比较方差齐性下采用LSD方法,方差不齐时采用Dunnett T3方法。P<0.05提示差异具有统计学意义。

结果：1.GFP小鼠组中,体外预变性1周后坐骨神经组织切片绿色荧光表达最强,p75荧光表达最强,说明体外预变性的时间是一周；

2. GFP小鼠组中,SCCM组中1、2、3周绿色荧光表达和p75荧光表达最强。SCCM组与DMEM组和DMEM+10%FBS组及对照组雪旺细胞数、细胞纯度和细胞密度均具有统计学差异（P<0.05）。

3.C57小鼠组中,对于SCCM培养液中预先培养的坐骨神经获取的细胞S100p蛋白的免疫荧光染色,发现几乎所有的双极或三极样细胞均为阳性,随机选取三个视野计算纯度为98%。SCCM组与DMEM+10%FBS组和对照组比较,雪旺细胞数和细胞密度均具有统计学差异（P<0.05）。各组原代细胞培养48小时后,雪旺细胞纯度,DMEM+10%FBS、SCCM中分别为82.83±3.43%,89.67±3.14%。

参考文献

[1]Identification of the ca2+in dependent enddoeytic hyaluronan receptor photaffinity crosslinking reagent.Yannariello-Brown J,Frost ST,Weigel PH,etal.Journal of Biochemistry.1992

[2]The Biomedical Engineering Handbook.Bellamkonda R,Aebischer P.CRC.1995

[3]Factors influencing the release of proteins by cultured schwann cells.DJ Carey,RP Bun.The Journal of Cell Biology.1981

[4]Axons regulate Schwann cell expression of the major myelin and NGF receptor genes.G Lemke,M Ch.Development.1988

[5]汪海滨.成年小鼠坐骨神经雪旺细胞体外培养的实验研究[D].南方医科大学,2013.