人氧化型谷胱甘肽(GSSG)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人氧化型谷胱甘肽(GSSG)ELISA试剂盒可以定量测定人血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中GSSG含量。

实验原理:

用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗GSSG抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗GSSG抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的GSSG呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人氧化型谷胱甘肽(GSSG)ELISA试剂盒

操作步骤:

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100ul，余孔分别加标准品或待测样品100ul，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。

为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100ul（在使用前一小时内配制），37℃,60分钟。

3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

4.每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液）100ul，37℃，60分钟。

5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

6.依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7.依序每孔加终止溶液50ul，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后立即进行检测。

应用^[4][5]

用于慢肾康宁对肾间质纤维化大鼠肾组织的影响及其SIRT1/COX-2表达调控的实验研究

观察慢肾康宁对腺嘌呤诱导的肾间质纤维化模型大鼠肾组织的保护作用及其对沉寂信息调节因子、环氧化酶2表达水平的影响，并且在慢性肾衰竭状态下衡量大鼠氧化应激的水平，以进一步探讨肾间质纤维化的作用机制。

方法：Wistar雄性大鼠60只，随机抽取7只大鼠做为正常组，其余为模型组53只。用腺嘌呤灌胃诱导肾间质纤维化大鼠模型。造模成功后，随机分为5组，分别为模型对照组、氯沙坦组、慢肾康宁高剂量组、慢肾康宁中剂量组、慢肾康宁低剂量组。氯沙坦组予腺嘌呤lOmg.kgid-1*：浓度为0.2%)灌胃；

慢肾康宁高剂量组：予腺嘌呤SO-mg.k-gM-1*：浓度为300%)灌胃1；慢肾康宁中剂量组：予腺嘌呤lS-mg.kgM（浓度为150%）灌胃;慢肾康宁低剂量组:予腺嘌呤T.Smg.kg-M-1（浓度为75%）灌胃。正常组、模型对照组给予等量蒸馏水（0.5ml/100g）灌胃，持续给药时间30天。

检测大鼠血肌酐、尿素氮、24小时尿蛋白量定量、肾小球滤过率水平。并通过常规制作石蜡切片，行HE染色及Masson染色观察肾脏组织病理形态的变化，利用试剂盒检测肾组织双氧水含量、氧化型谷胱甘肽及还原型谷胱甘肽，并采用免疫组化和实时荧光定量PCR测定肾组织沉寂信息调节因子、环氧化酶2蛋白及mRNA表达水平。

参考文献

[1]Cyclo-oxy-genase-2inhibition attenuates the progression of nephropathy in uninephrectomized diabetic rats.KOMERS R,LINDSLEY J,OYAMA T T,et al.Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology.2007

[2]Prevalence of chronic kidney disease in the United States.Coresh J,Selvin E,Stevens LA,et al.The Journal of The American Medical Association.2007

[3]Pathophysiological roles of aldosterone and mineralocorticoid receptor in the kidney.Rafiq K,Hitomi H,Nakano D,Nishiyama A.Journal of Pharmacological Sciences.2011

[4]Aldosterone-induced kidneyinjury is mediated by NF k B activation.FukudaS,Horimai C,Harada K,et al.Clinical and Experimental Nephrology.2011

[5]聂玲辉.慢肾康宁对肾间质纤维化大鼠肾组织的影响及其SIRT1/COX-2表达调控的实验研究[D].暨南大学,2013.