大肠杆菌膜蛋白提取试剂盒的应用

背景^[1-3]

大肠杆菌膜蛋白提取试剂盒是一种高效的高产膜蛋白提取试剂盒。大肠杆菌膜蛋白提取试剂盒可以从各种大肠杆菌菌体中提取膜蛋白,可用于纯化蛋白的粗品制备及膜蛋白制备。提取过程简单方便。该试剂盒含有蛋白酶抑制剂混合物,阻止了蛋白酶对蛋白的降解,为提取高质量的蛋白提供了保证。

大肠杆菌膜蛋白提取试剂盒提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。

大肠杆菌膜蛋白提取试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白,下游应用范围广,提取液裂解细胞的能力较温和,需要根据实际样本情况优化裂解时间。

大肠杆菌膜蛋白提取试剂盒

使用方法：

1．每500μl冷的提取液A中加入5μl提取液B和2μl蛋白酶抑制剂混合物，充分混匀后置冰上备用。

2．离心收集菌体，用PBS洗菌体2次。

3．按每100mg-150mg湿重菌体样本加入500μl冷的提取液A(大约菌体和提取液体积比1:3-1:5，完全淹没菌体即可)，吹打混匀，在2-8℃振荡1-2小时，至菌体裂解完全，菌体沉淀减少。

4．将菌体提取液在2-8℃低温下12000×g力离心5分钟，弃沉淀，取上清。

5．将上清液在37℃水浴10分钟。

6．在37℃，1000g离心3分钟。

7．此时液体分为2层，小心移除上层溶液，留管底部下层，大约50μl液体。

8．用1-2倍体积的膜蛋白溶解液溶解该下层部分，即得大肠杆菌膜蛋白样品。

9．将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。

应用^[4][5]

用于铁离子对大肠杆菌外膜蛋白OmpW的调控机制研究

通过Western blotting发现，在不同铁离子浓度下OmpW的表达发生改变，证实OmpW受铁离子调控。进而通过构建重组载体pACYC184-ompW，并转化ompW基因敲除菌（ΔompW）得到ompW基因补救菌（+ompW）。经菲洛嗪洛比色法分析正常菌、ΔompW和+ompW摄取铁离子差异，表明ΔompW菌摄入的铁离子较多，而K12和+ompW对铁离子的摄入较少，推测OmpW可能与铁离子摄取有关。

此外，利用Real-Time qPCR检测正常和限铁条件下转录因子的表达，结果发现限铁下转录因子Fur表达量下调，而SoxS没有明显改变，表明Fur可能参与铁对OmpW的调控。

为进一步确定转录因子的作用，运用载体pET-28a（+）构建了转录因子的高表达菌，然后利用Real-Time qPCR和Western blotting检测OmpW的表达情况，发现Fur高表达菌中OmpW的表达量上调，而SoxS高表达菌中OmpW的表达量下调。

综上所述，这些结果表明铁离子通过Fur对OmpW发挥调控作用。该结果从新的角度揭示了铁离子促进细菌毒力和致病性的作用机制，为全面、深入揭示铁介导细菌毒力及致病机制提供新思路及奠定基础，也为防治铁介导的细菌感染疾病提供新靶点，本研究具有重要的理论意义和应用价值。

参考文献

[1]Expression of the E scherichia coli ompW colicin S 4 receptor gene is regulated by temperature and modulated by the H‐NS and S tp A nucleoid‐associated proteins[J].Luciano Brambilla,Jorgelina Morán‐Barrio,Alejandro M.Viale.FEMS Microbiol Lett.2014(2)

[2]Invasin of E dwardsiella tarda is essential for its haemolytic activity,biofilm formation and virulence towards fish[J].X.Dong,X.Fan,B.Wang,X.Shi,X.‐H.Zhang.J Appl Microbiol.2013(1)

[3]Profligate biotin synthesis inα‐proteobacteria–a developing or degenerating regulatory system?[J].Youjun Feng,Huimin Zhang,John E.Cronan.Molecular Microbiology.2013(1)

[4]Role of iron homeostasis in the virulence of phytopathogenic bacteria:an‘àla carte’menu[J].Thierry Franza,Dominique Expert.Molecular Plant Pathology.2012(4)

[5]叶智鸧.铁离子对大肠杆菌外膜蛋白OmpW的调控机制研究[D].浙江理工大学,2015.