小鼠海绵体内皮细胞的应用

背景^[1-3]

小鼠海绵体内皮细胞采用混合酶消化法结合机棍分离法、并通过专用培养基培养筛选制备而来，细胞总量约为5×105cells/T25/瓶；细胞纯度可达90%以上、而且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌酵母、和真菌等。

小鼠海绵体内皮细胞分离自海绵体组织；阴茎海绵体是由海绵状的小梁和腔隙构成的血窦结构，它主要包括海绵体内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞3种细胞成分。其中平滑肌细胞和成纤维细胞镶嵌于海绵体细胞外基质的胶原中，而海绵体内皮细胞则覆盖于海绵体血窦的腔面，仅占海绵体组织的2.8%。

小鼠海绵体内皮细胞

在消化海绵体组织时，胶原酶的作用主要是松解海绵体内皮细胞与基膜的联系，破坏海绵体内皮细胞间的紧密连接。如果消化时间延长或胶原酶浓度过大，平滑肌细胞和成纤维细胞也将被消化下来，从而影响海绵体内皮细胞的纯度。因此，比较筛选合适的胶原酶浓度和消化时间是成功分离海绵体内皮细胞的关键。

培养操作：

1）复苏细胞：将含有细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。隔天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

应用^[4][5]

用于阴茎海绵体注射基质血管组分改善Ⅰ型糖尿病小鼠勃起功能的研究

探究单次阴茎海绵体内注射基质血管组分（SVF）治疗糖尿病小鼠勃起功能障碍的疗效及作用机制。

方法:8周龄C57BL6J雄性小鼠随机分为4组:正常对照（Normal）组、糖尿病未治疗（No treatment）组、海绵体内注射PBS（DM+PBS）组和海绵体内注射SVF（DM+SVF）组。正常实验小鼠通过低剂量（50mg/kg/d）连续5天腹腔注射链脲佐菌素,诱导建立Ⅰ型糖尿病（DM）小鼠模型,根据体重及血糖值筛选出糖尿病小鼠,在DM小鼠建模8W后,勃起力测定技术证实DM小鼠并发勃起功能障碍,成功构建糖尿病性勃起功能障碍小鼠模型,Normal组和No treatment不做任何治疗处理,PBS组和SVF组阴茎海绵体内分别一次性注射20ul的1x PBS和新鲜分离提取自e GFP小鼠附睾脂肪组织的SVF细胞（1x105cells/20ul）。

局部注射2W后,在动物活体实验中,通过电刺激小鼠阴茎海绵体神经,记录海绵体组织勃起时的内压（ICP）,记录电刺激之前小鼠的系统血压（MSBP）,使用ICP/MBSP评估小鼠的勃起功能。处死小鼠后,立即获取阴茎海绵体组织,进行分子生物学实验,通过免疫荧光染色技术检小鼠测海绵体内VEGF-A、PH3、CD31和p-e Nos的表达水平变化,通过ELISA方法检测小鼠海绵体组织内c GMP浓度变化。

结果:糖尿病小鼠的勃起功能显著低于正常小鼠（P<0.05）,局部阴茎海绵体内注射治疗2W后,SVF组糖尿病小鼠的勃起功能显著改善,ICP/MBSP比值明显高于No treatment组和PBS组（P<0.05）。

参考文献

[1]New approaches to the design and discovery of therapies to prevent erectile dysfunction[J].Haroldo A Toque,Robert William Caldwell.Expert Opinion on Drug Discovery.2014(12)

[2]Endothelin‐1 contributes to endothelial dysfunction and enhanced vasoconstriction through augmented superoxide production in penile arteries from insulin‐resistant obese rats:role of ETA and ETB receptors[J].A Sánchez,P Martínez,M Mu?oz,S Benedito,A García‐Sacristán,M Hernández,D Prieto.Br J Pharmacol.2014(24)

[3]Impaired Endothelin Calcium Signaling Coupled to Endothelin Type B Receptors in Penile Arteries from Insulin-Resistant Obese Zucker Rats[J].Cristina Contreras,Ana Sánchez,Pilar Martínez,Belén Climent,Sara Benedito,Albino García-Sacristán,Medardo Hernández,Dolores Prieto.The Journal of Sexual Medicine.2013(9)

[4]Erectile dysfunction in the cardiovascular patient[J].Charalambos Vlachopoulos,Graham Jackson,Christodoulos Stefanadis,Piero Montorsi.European Heart Journal.2013(27)

[5]林向楠.阴茎海绵体注射基质血管组分改善Ⅰ型糖尿病小鼠勃起功能的研究[D].青岛大学,2017.