TM4细胞的应用

背景^[1-3]

TM4细胞是来源于正常小鼠睾丸的上皮细胞样贴壁细胞，TM4细胞在FSH的作用下cAMP产量增加，但对LH无反应；TM4细胞与原代Sertoli细胞相比，对FSH的反应性降低。据报道，TM4细胞组成性纤溶酶原激活物的产量很低，但可被FSH刺激产生，受维甲酸刺激可有大幅增高。TM4细胞可产生视黄醇结合蛋白、组织纤溶酶原激活物和转铁蛋白；TM4细胞表达FSH受体、雄激素受体和孕激素受体；鼠痘病毒阴性。

TM4细胞

培养步骤：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

传代方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

应用^[4][5]

用于PGC-1α在铅致睾丸支持细胞氧化应激与能量代谢中的作用研究

通过醋酸铅处理TM4细胞株和过表达PGC-1α的TM4细胞株（简称PGC-1α（+）TM4细胞株）及低表达PGC-1α的TM4细胞株（简称PGC-1α（-）TM4细胞株）,来研究PGC-1α在铅导致睾丸支持细胞的氧化应激与能量代谢中的作用。

方法：醋酸铅处理PGC-1α（-）TM4、TM4和PGC-1α（+）TM4细胞株24小时后,用RT-PCR测细胞内PGC-1α、SIRT3 mRNA表达量;采用DHE荧光探针染色,分别用流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光显微镜检测细胞内ROS含量;分别用ATP含量测定试剂盒及LD含量测定试剂盒检测细胞内ATP及LD含量;分别用LDH活性测定试剂盒、SDH活性测定试剂盒、Na+-K+-ATP酶活性测定试剂盒及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性测定试剂盒检测细胞内LDH、SDH、Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。

结果：①RT-PCR结果显示,随着染毒浓度的增加,TM4细胞和PGC-1α（+）TM4细胞中PGC-1α及SIRT3 mRNA水平呈先升高后降低的趋势,而PGC-1α（-）TM4细胞中PGC-1α及SIRT3mRNA水平呈逐渐降低的趋势,且与对照组有统计学差异,P<0.05。相同浓度醋酸铅处理后,TM4细胞内PGC-1α及SIRT3 mRNA表达明显低于PGC-1α（+）TM4细胞,而高于PGC-1α（-）TM4细胞。

②流式细胞仪结果显示,随着醋酸铅浓度的升高,TM4、PGC-1α（-）TM4和PGC-1α（+）TM4细胞内ROS水平均呈逐渐升高的趋势,显示了醋酸铅暴露与ROS水平升高的剂量效应关系,并且PGC-1α（+）TM4>TM4>PGC-1α（-）TM4（P<0.05）。荧光酶标仪检测ROS水平可以看到上述相同的趋势,细胞的ROS均随着醋酸铅浓度的升高而升高（P<0.05）,但相同浓度的醋酸铅处理后,PGC-1α（+）TM4细胞的ROS水平比TM4细胞降低了33.7%～45.2%,而TM4细胞内ROS水平比PGC-1α（-）TM4细胞降低了65%～85%。荧光显微镜结果显示,随着醋酸铅浓度的升高,与各自对照组相比,三组细胞内的荧光强度逐渐增强,说明细胞内的ROS水平升高,并且,相同浓度组中,TM4细胞内的荧光强度低于PGC-1α（-）TM4细胞,而高于PGC-1α（+）TM4细胞。

③ATP含量测定结果显示,与对照组相比,各浓度PGC-1α（-）TM4、TM4及PGC-1α（+）TM4细胞、内ATP的含量均下降,差异有统计学意义（P<0.05）;且随着乙酸铅染毒浓度升高,TM4及其过表达、低表达细胞内ATP的含量均呈下降趋势。当乙酸铅染毒浓度相同时,3种细胞内ATP的含量依次为PGC-1α（+）TM4>TM4>PGC-1α（-）TM4,差异均有统计学意义（P<0.05）。

参考文献

[1]The role of HO-1 in protection against lead-induced neurotoxicity[J].Xiaoyi Li,Fang Ye,Lili Li,Wei Chang,Xiongwen Wu,Jun Chen.Neurotoxicology.2016

[2]The role of Nrf2 in protection against Pb-induced oxidative stress and apoptosis in SH-SY5Y cells[J].Fang Ye,Xiaoyi Li,Lili Li,Ling Lyu,Jing Yuan,Jun Chen.Food and Chemical Toxicology.2015

[3]Cytotoxicity of cardiotonic steroids in sensitive and multidrug-resistant leukemia cells and the link with Na+/K+-ATPase[J].Maen Zeino,Ruth Brenk,Lisa Gruber,Martin Zehl,Ernst Urban,Brigitte Kopp,Thomas Efferth.Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Bio.2015

[4]Environmental exposure to lead induces oxidative stress and modulates the function of the antioxidant defense system and the immune system in the semen of males with normal semen profile[J].Aleksandra Kasperczyk,Micha?Dobrakowski,Zenon P.Czuba,Stanis?aw Horak,S?awomir Kasperczyk.Toxicology and Applied Pharmacology.2015(3)

[5]刘茜.PGC-1α在铅致睾丸支持细胞氧化应激与能量代谢中的作用[D].武汉大学,2017.