葡萄糖-6-磷酸酶染色试剂盒(铅法)的应用

背景^[1-3]

葡萄糖-6-磷酸酶染色试剂盒(铅法)是葡萄糖-6-磷酸酶体外染色检测试剂盒主要用于组织中葡萄糖-6-磷酸酶的染色定位。

葡萄糖-6-磷酸酶染色试剂盒(铅法)主要由孵育液、硝酸钴、硫化铵、等组成，酶活性部位呈棕色沉淀。葡萄糖-6-磷酸酶染色液(铅法)采用重金属捕捉剂和磷酸结合显示酶的活性。该酶对固定很敏感，组织经80%乙酸溶液固定后用石蜡包埋，G-6-Pase完全被抑制。

葡萄糖-6-磷酸酶

葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6―phosphatase，G-6―P)定位于肝、肾、肠黏膜的微体及内质网内。主要有两方面的生理功能：一方面通过水解葡萄糖-6-磷酸释放葡萄糖来控制葡萄糖释放人血的量；另一方面，在一定条件下通过其磷酸转移酶活性合成葡萄糖-6-磷酸。

糖尿病患者血糖浓度增高的同时，伴有葡萄糖-6-磷酸酶的磷酸转移酶活性增高，其作用是取代肝内的葡萄糖激酶，使葡萄糖转向糖原合成。

铅法：葡萄糖-6-磷酸水解后所释放出磷酸，为硝酸铅所捕获，经硫化铵处理，最终反应产物为颗粒状的硫化铅沉淀。

反应通式如下：葡萄糖―6―磷酸钠+H2O葡萄糖-6-磷酸酶葡萄糖+磷酸Pb(NO3)2 Pb3(PO4)2(NH4)2S PbS↓。

染色程序：

①新鲜组织冰冻切片；

②10％福尔马林固定5分钟后水洗；

③切片入孵育液中，37℃孵育20分钟水洗；

④人1％硫化铵水溶液中1分钟水冲洗；

⑤3％福尔马林后固定10分钟；

⑥甘油明胶封固。

应用^[4][5]

用于当归多糖治疗代谢综合征相关疾病的作用及机制研究

利用高热量饮食长期喂养小鼠,外加注射链脲佐菌素（STZ）破坏胰岛β细胞建立T2DM小鼠模型,再用当归多糖灌胃治疗四周。

实验中定期监测小鼠体重和空腹血糖浓度（FBG）;治疗结束后进行口服葡萄糖耐量测试（OGTT）,检测小鼠肝重指数、糖化血红蛋白（HbA1c）含量、血清TC、血清TG、血清HDL-c、血清LDL-c、血清ALT、血清AST和肝糖原含量;检测血清胰岛素、葡糖激酶（GK）和葡萄糖6磷酸酶（G6Pase）水平;制作组织切片,观察胰岛H&E染色切片和肝脏油红O染色切片;WB法检测小鼠肝脏胰岛素通路相关蛋白IRS-2、PI3K、Akt、p-Akt和GLUT2。

另外,为明确当归多糖对胰岛素通路的刺激作用,我们还建立胰岛素抵抗HepG2细胞模型,当归多糖培养后检测细胞中p-IRβ、p-IRS1、p-IPI3K和p-Akt含量,观察当归多糖对胰岛素通路的调控作用。

实验过程中,T2DM小鼠出现“三多一少”的症状,即多饮、多尿、多食和体重减轻。当归多糖对减少的体重没有影响,但是可以降低T2DM小鼠升高的肝重指数。T2DM小鼠FBG和HbA1c明显升高,超过11.1mmol/L,葡萄糖耐受力显著降低;当归多糖治疗后T2DM小鼠血糖显著降低,葡萄糖耐受力明显提升。此外,T2DM小鼠出现了明显的血脂紊乱和肝损伤（ALT和AST水平提高）,当归多糖可以明显调控这些生物标志物更趋于正常水平。

组织学观察表明T2DM小鼠胰岛严重损坏,当归多糖可适度修复胰岛;肝脏油红O切片显示T2DM小鼠肝脏有大量脂肪堆积,同样,当归多糖可适度缓解脂肪肝。值得注意的是,当归多糖可以大幅度提高小鼠血清胰岛素水平,提示我们当归多糖可能对胰岛素通路有独特的作用。

WB法检测小鼠肝脏胰岛素通路相关蛋白,结果表明当归多糖可显著提高通路关键蛋白的表达量,提示当归多糖可能对胰岛素通路有刺激作用,从而发挥降血糖作用。

参考文献

[1]Editorial:screening for NAFLD–a promising strategy to mitigate future burden of liver disease[J].R.Sinha,K.A.Lockman.Aliment Pharmacol Ther.2016(1)

[2]Resveratrol attenuates high glucose-induced oxidative stress and cardiomyocyte apoptosis through AMPK[J].Shuang Guo,Qing Yao,Zhiqiang Ke,Hongguang Chen,Jiliang Wu,Chao Liu.Molecular and Cellular Endocrinology.2015

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[5]曹鹏.当归多糖治疗代谢综合征相关疾病的作用及机制研究[D].华中科技大学,2017.