OCT-4免疫荧光试剂盒(IF)的应用

背景^[1-3]

OCT-4免疫荧光试剂盒(IF)可用于免疫荧光方法以显示人、大、小鼠来源的组织样本Oct-4抗原的分布。本试剂盒适用于常规福尔马林固定石蜡包埋切片、冰冻切片、培养固定的细胞爬片等。

OCT-4免疫荧光染色

操作方法：（以石蜡切片为例）

1.石蜡切片二甲苯脱蜡、梯度酒精水化，用PBS(pH7.4)冲洗三次，每次3分钟（3x3min）。（注意：从此步骤起，严禁标本或组织切片干燥）。

2.抗原修复（选做步骤：石蜡组织切片建议进行蛋白酶K修复20ug/ml，37℃，30min）。

3.除去PBS液，每片加50~100µl的10%山羊血清封闭液（自备），湿盒内室温或37度孵育30分钟。PBS洗涤3×2min。

4.除去PBS液，每张切片加50~100µl的Oct-4兔多抗(用户根据实验需要进行自选，用量体积按完全覆盖组织为准，建议抗体稀释比例为：固定细胞1:100-500；冰冻切片1:100-500；石蜡切片1:50-200)，湿盒内室温（或37度）孵育60分钟或4℃过夜。PBS洗涤3×2min。

5.除去PBS液，每张切片加50~100µl荧光标记二抗工作液（体积用量按完全覆盖组织为准，FITC标记羊抗兔IgG，PBS稀释抗体1:50~1:200）。PBS洗涤3×2min。

6.除去PBS液，以甲醇稀释20×DAPI溶液至1×，每片加50~100µl避光染色10~15min。

7.PBS洗涤2次，以甘油明胶（60%甘油-PBS）或者防淬灭封片胶封片，在荧光显微镜下观察拍照。

应用^[4][5]

用于Oct4调控动脉平滑肌细胞表型转化在胸主动脉夹层形成中的作用及机制研究

探究Oct4对胸主动脉夹层发病过程中HASMC表型转化的影响及机制。

研究方法:1.组织标本的收集:12例升主动脉夹层组织取自Stanford A型夹层病人。6例正常升主动脉组织取自未患有血管疾病的捐献者。

2. HASMC的原代培养:原代人主动脉平滑肌细胞分离自3例夹层组织和3例正常主动脉组织。小心剥离动脉的内膜和中膜后,主动脉中膜被剪成4×4毫米大小的小块,并接种于24孔板中,每孔1-2个组织块。在孔内加入300ul含有20%FBS的DMEM培养基,每周换液两次。

3. 免疫组织化学染色:主动脉切片脱蜡、抗原修复并抑制内源性过氧化物酶后,孵育一抗,然后孵育辣根过氧化物酶标记的二抗,最后采用DAB进行显色。

4. 免疫荧光染色:福尔马林固定HASMCs后,依次孵育一抗和荧光二抗。细胞核用DAPI衬染。

5. 小RNA干扰及转染:按照Lipofectamine 2000说明书提供的方法转染si RNA至HASMCs中。

6. 平板划线:用200ul移液器枪头在单层细胞中央划出一条直线,分别于划痕后0小时和24小时拍照,评价细胞迁移能力。

7. Western Blot和q RT-PCR分别用于检测组织和细胞中蛋白和m RNA的表达水平。

8. 荧光素酶报告基因:野生型和突变型KLF5启动子区序列的PCR扩增产物分别克隆至p GL3-basic载体质粒的荧光素酶基因上游,构建p GL3-Pro-WT-KLF5 and p GL3-Pro-MT-KLF5质粒。

通过PCR方法克隆人类基因组DNA中的Oct4 CDS区序列,构建Oct4过表达质粒,pc DNA-Oct4。采用双荧光素酶分析系统检测荧光素酶活性。启动子活性以海肾荧光素酶活性校正后的细胞裂解液荧光素酶活性表示。

参考文献

[1]Vascular Smooth Muscle Cells in Atherosclerosis[J].Martin R.Bennett,Sanjay Sinha,Gary K.Owens.Circulation Research.2016(4)

[2]15‐Lipoxygenase Promotes Chronic Hypoxia‐Induced Phenotype Changes of PASMCs Via Positive Feedback‐Loop of BMP4[J].Xiufeng Yu,Liuping Wei,Ping Lu,Tingting Shen,Xia Liu,Tingting Li,Bo Zhang,Hao Yu,Daling Zhu.J.Cell.Physiol..2015(7)

[3]Essential role of krüppel-like factor 5 during tumor necrosis factorα-induced phenotypic conversion of vascular smooth muscle cells[J].Seon Hee Kim,Sung Ji Yun,Young Hwan Kim,Jung Min Ha,Seo Yeon Jin,Hye Sun Lee,Sun Ja Kim,Hwa Kyoung Shin,Sung Woon Chung,Sun Sik Bae.Biochemical and Biophysical Research Communicatio.2015(4)

[4]Systems-level regulation of microRNA networks by miR-130/301 promotes pulmonary hypertension[J].Bertero,Thomas,Lu,Yu,Annis,Sofia,Hale,Andrew,Bhat,Balkrishen,Saggar,Rajan,Saggar,Rajeev,Wallace,W Dean,Ross,David J,Vargas,Sara O,Graham,Brian B,Kumar,Rahul,Black,Stephen M,Fratz,Sohrab,Fineman,Jeffrey R,West,James D,Haley,Kathleen J,Waxman,Aaron B,Chau,B Nelson,Cottrill,Katherine A,Chan,Stephen Y.Journal of Clinical Investigation.2014(8)

[5]阎岩.Oct4调控动脉平滑肌细胞表型转化在胸主动脉夹层形成中的作用及机制研究[D].第二军医大学,2016.