MDBK (NBL-1)牛肾细胞的应用

背景^[1-3]

MDBK(NBL-1)牛肾细胞是从一只表观正常的成年牛肾脏建立了MDBK细胞株。1973年这株MDBK细胞被牛病毒性痢疾病毒(BVDV)感染。1982年发现了一株未被BVDV感染的MDBK细胞株。这株细胞最初来自ATCC 1967年７月第96代的冻存管。这株MDBK细胞的后代经NVSL检测，未发现被任何病毒污染的证据。1982年８月，R.A.Van Deusen将其提供给ATCC时，已传代至第110代。这株细胞未被BVDV感染。

MDBK (NBL-1)牛肾细胞

细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

1.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

2.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

3.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

应用^[4][5]

用于牛传染性鼻气管炎TK/gE基因缺失重组病毒的研究

构建了牛疱疹病毒1型TK／gE双基因缺失突变株,并做了动物安全性和保护力试验,为研究缺失标志活病毒疫苗及研制表达外源基因的BHV-1重组病毒活载体疫苗奠定基础。

主要工作包括：1.牛传染性鼻气管炎TK-／gE-基因双缺失突变株的构建1)牛传染性鼻气管炎TK-/EGFP+突变株的构建本实验以牛疱疹病毒1型全序列（基因登录号为AJ004801）为基础,提取病毒全基因组。在此基础上设计引物,用PCR技术扩增TK基因上游和下游约1.0 kb和1.1kb的片段作为同源重组臂,分别克隆于载体pBluescriptⅡSK（+）中。用相应的限制性内切酶将下游同源臂回收,定向插入到上游的克隆载体中,构建中间转移载体,并命名为pZF08-21。然后插入带有完整启动子的EGFP报告基因,构建成重组转移质粒,并命名为pZF07-16。以磷酸钙转染法将经线性化的pZF07-16、质粒pBICP0与BHV-1基因组DNA在牛肾细胞（MDBK）上共转染,成功地进行了同源重组,7轮筛选和纯化获得了BHV-1 TK-/EGFP+突变株。

2) 牛传染性鼻气管炎TK-突变株的构建提取BHV-1 TK-/EGFP+突变株基因组,再次以磷酸钙转染法将经线性化的pZF08-21、质粒pBICP0与基因组DNA在MDBK上共转染,同源重组去掉EGFP荧光标签,经5轮纯化成功的获得了BHV-1 TK-突变株。

3) 牛传染性鼻气管炎TK-/gE-/EGFP+双缺失突变株的构建方法同,用PCR扩增gE基因上游和下游约1.0kb和1.1kb的片段,分别克隆于载体pcDNA3.1（+）myc-His B中。通过限制性酶切将上游同源臂回收,插入到下游的克隆载体中,构建中间转移载体,并命名为pZF09-08。然后插入EGFP报告基因,构建成重组转移质粒,并命名为pZF09-15。

4) 以磷酸钙转染法将经线性化的pZF09-15、质粒pBICP0与BHV-1 TK"缺失突变株基因组DNA在MDBK细胞上共转染,成功地进行同源重组,经过7轮筛选和纯化获得了BHV-1 TK-/gE-/EGFP+突变株。

参考文献

[1]Critical assessment of an in vitro bovine respiratory organ culture system:A model of bovine herpesvirus-1 infection[J].H.S.Niesalla,A.Dale,J.D.Slater,S.F.E.Scholes,J.Archer,D.J.Maskell,A.W.Tucker.Journal of Virological Methods.2009(1)

[2]Bovine herpesvirus type 1 induces cell death by a cell-type-dependent fashion[J].Vicki Geiser,Suzanne Rose,Clinton Jones.Microbial Pathogenesis.2008(6)

[3]Glycoprotein E（gE）specified by bovine herpesvirus type 5（BHV-5）enables trans-neuronal virus spread and neurovirulence without being a structural component of enveloped virions[J].A.Al-Mubarak,J.Simon,C.Coats,J.D.Okemba,M.D.Burton,S.I.Chowdhury.Virology.2007(2)

[4]Bovine herpesvirus type 1（BHV-1）up-regulates telomerase activity in MDBK cells[J].U.Pagnini,L.De Martino,S.Montagnaro,A.Diodato,M.Longo,F.Pacelli,G.Pisanelli,G.Iovane.Veterinary Microbiology.2005(3)

[5]定明.牛传染性鼻气管炎TK/gE基因缺失重组病毒的研究[D].华中农业大学,2010.