索非布韦杂质的检测

背景及概述^[1][2][3]

索非布韦( sofosbuvir) 属于HCV 特异性NS5B聚合酶的核苷抑制剂，能作用于病毒RNA 复制的核苷酸类似物NS5B 聚合酶位点，中止病毒复制，是以NS5B 聚合酶为靶点的唯一上市品种，用于治疗慢性丙肝。该药需要和利巴韦林( 或再联合干扰) 联合用药，相对于原有的丙肝一线治疗方案，干扰素+ 利巴韦林联合疗法( 患者深受干扰素的激素副作用的影响不能彻底清除丙肝病毒，无法治愈) ，该复方药更安全，疗效更佳，且可以彻底根除丙肝病毒，被医学界视为治疗丙肝的突破性药物。

索非布韦片现专利权由美国吉利德( Gilead) 公司所有，于2013 年以商品名Sovaldi 首先获得FDA 批准上市。2015 年印度Natco 公司仿制成功索非布韦片，并以商品名Hepcinat 上市销售，目前中国还没有药厂生产该药。2013 年12 月FDA 批准美国吉利德科学公司( Gilead Sciences) 研发的口服治疗丙肝( HCV) 药物索非布韦上市，成为该年度获批的最重要的新药之一，并很快证明为全球重磅药物。

丙肝患者服用12 周持续病毒学应答率达到95% 以上，临床效果显著，以至于默克的grazoprevir /elbasvir 和施贵宝的daclatasvir 失去了FDA 的“突破性药物”资格，亦使其他抗丙肝药物黯然失色。因其疗效突出、副作用小等优点，索非布韦迅速拿下了美国，欧盟，日本三大主流市场。吉利德更是定价1000 美金/片，一个疗程高达8. 4 万美金，获得高额利润的同时，其高昂的售价也饱受争议。

吉利德为了避免被发展中国家抵制，在包括埃及、印度在内的28 个发展中国家授权仿制药企业生产，可在该国家内低价销售，其中印度Natco 公司仿制的索非布韦片( 商品名Hepcinat) 售价仅为美国的约1%，900 美元/12 周，为更广大的收入不丰厚人群带来福音。检索到有用HPLC 法测定索非布韦的含量，还有人采用对索非布韦进行体内药物分析，各国药典均未收载该药，索非布韦有关物质的研究报道较少。

结构^[1]

索非布韦中主要含有杂质A、杂质B、杂质C，其结构如下：

此外，还含有索非布韦基因毒杂质五氟苯酚。

检测方法^[1][2]

HPLC 法测定索非布韦杂质A、杂质B、杂质C检测方法：

1. 色谱条件

Waters Symmetry C18( 4. 6 mm × 150 mm，5 μm)色谱柱，流动相为0. 01 mol/L磷酸二氢钠溶液( 用磷酸调节pH 值至3. 0) -乙腈( 75∶ 25) ；流速为1. 0mL/min； 检测波长为210 nm；柱温30 ℃；进样量20 μL。

2. 溶液的配制

1）供试品溶液称取索非布韦片10 片，研细，精密称取细粉适量( 约相当于索非布韦100 mg) ，置200 mL 量瓶中，加流动相适量，超声(功率400 W，频率53 kHz) 使溶解，放冷，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2）对照溶液精密量取供试品溶液1 mL，置100 mL 量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

3）杂质储备溶液取杂质A、杂质B 和杂质C对照品各约10 mg，精密称定，分别置3 个200 mL量瓶中，加流动相适量，超声(功率400 W，频率53kHz) 使溶解，放冷，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为杂质储备溶液。

4）杂质对照品溶液精密量取杂质储备溶液各4 mL，置100 mL 量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为杂质对照品溶液。

5）系统适应性溶液精密称取索非布韦对照品25 mg，置50 mL 量瓶中，加流动相适量，超声(功率400 W，频率53 kHz) 使溶解，放冷，精密加入杂质储备溶液2 mL，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为系统适应性溶液。

6）空白辅料溶液按照处方制成不含主药成分的索非布韦片，按照方法操作，作为空白辅料溶液。

3. 有关物质检查方法

精密量取系统适应性溶液、供试品溶液、对照溶液、杂质对照品溶液、空白辅料溶液各20 μL 注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2 倍。供试品溶液色谱图中如有与杂质对照品溶液保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，不得过0. 4%；其他单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0. 5 倍( 0. 5%)；杂质总量不得过1. 0%。

索非布韦中基因毒性杂质五氟苯酚检测方法，包括以下步骤：

(1) 选取HPLC级乙腈为空白溶剂；

(2) 用电子天平精密称定200mg索非布韦于10ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻 度，摇匀，即得浓度为20mg/ml的供试品溶液；

(3) 用电子天平精密称定15mg五氟苯酚于10ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度， 然后量取该溶液1.0ml于200ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，再量取该稀释溶液1.0ml 于100ml量瓶中，并加乙腈溶解稀释至刻度，摇匀，即得浓度为75ng/ml的对照品溶液；

(4) 分别精密量取步骤(1)空白溶剂20μl、步骤(2)供试品溶液20μl和步骤(3)对照品溶液20μl，注入安捷伦Agilent-6430 液质联用仪，记录色谱图，并根据各色谱图，通过外 标法定量分析得出五氟苯酚的含量；所述高效液相色谱条件为：色谱柱：Supor C18 UPLC， 1.8μm，2.1×100mm，柱温：35℃，流动相：乙腈/水，体积比为90：10，流速0.2ml/min，进样量 20μl；所述质谱条件为：ESI-，质核比183，驻留时间200ms，Fragmentor电压110V。

该方法优点在于：该检测方法中溶剂不干扰五氟苯酚检测，样品中无干扰五氟苯酚测定的峰，方法专属性良好，且该检测方法简便、快速、准确、灵敏度高、准确度好、重复性好。样品的加样回收率在80～115％之间，样品重复性的相对标准偏差不大于2％，五氟苯酚量限为0.75ng/ml，检测限为0.22ng/ml，适用于索非布韦原料药基因毒性杂质五氟苯酚的测定。

主要参考资料

[1] 贾首时, 王萌萌, 王超众. HPLC 法测定索非布韦片的有关物质[J]. 中国药品标准, 2018, 19(1): 38-43.

[2] CN201710601526.9 一种高效液相色谱-串联质谱联用检测索非布韦中基因毒性杂质五氟苯酚的方法 

[3] 毛丹. 新型丙型肝炎病毒抑制剂索非布韦的中国专利申请状况分析[J]. 中国新药杂志, 2015, 24(15): 1698-1701.