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异硫氰酸荧光素在荧光领域的应用

发布日期:2018/11/16 13:56:48

背景及概述[1]

异硫氰酸荧光素( Flourescein isothiocyanate,FITC) 是一种在细胞生物学、 免疫学、药物研究领域广泛应用的荧光素类标记物。FITC 是在荧光素的结构上引入异硫氰基( -N=C= S) 得到的,异硫氰基通过与被标记物如蛋白质的伯胺基团反应形成硫脲键,成为牢固的荧光染料—蛋白质结合物,从而实现对目标分子的荧光标记。FITC最大发射波长为520~530nm,最大吸收波长为490~495 nm,在碱性溶液中具有强烈的黄绿色荧光,加酸后沉淀析出,荧光消失。FITC性质稳定、荧光量子产率高、无毒、成本低,对所处微环境的变化很灵敏,适合作探针分子。与抗体、蛋白质类结合可用于定性、定量检测,与糖类结合则可用于糖类在体内的代谢研究,亦可用于标示药物载体、聚合物微粒进行药物靶向性及示踪研究。

应用[1]

1 FITC 在荧光标记领域的应用

1. 1 用于蛋白质类药物的示踪研究

FITC 是用于标记生物相关蛋白质分子最广泛的一个荧光探针. 通过与不同抗体结合后,广泛用于治疗性抗体如 TCR( T细胞抗原受体,T cell receptor) 的研究, 也可与蛋白质类成分结合后观察其组织和细胞行为,Celine Hoffmann 等用 FITC 标记人血浆纤维连接蛋白(FN) ,用 FITC /Fn 不同控释比为评价指标, 观察 FN 的组织和细胞行为。周新阳等用 20 mg 天花粉蛋白与 0.4 mg FITC 反应制备得到 FITC-天花粉蛋白标记物,通过观察天花粉蛋白进入黑色素瘤 B16 细胞的动态过程,发现孵育 6 h时 FITC-天花粉蛋白对细胞 DNA 没有明显的损伤作用;而孵育 12 h 时对黑色素瘤 B16 细胞产生明显的细胞毒作用和凋亡。张倩等制备了 FITC 与鹿茸蛋白混合物(PE) 的荧光标记复合物 FITC-PE,观察到该标记蛋白在消化道中荧光强度及蛋白含量均会削减,但蛋白主要成分保持不变,相对分子质量小于 45 kD 的蛋白可以透过肠壁吸收入血。双标记流式细胞术检测细胞凋亡是FITC 的一项成熟应用。用FITC标记磷脂结合蛋白 V( Annexin V),再与 PI(碘化丙啶) 匹配使用,可检测细胞凋亡,称为 Annexin V-FITC/PI 双染色法。国内研究者也利用该法观察到许多天然活性成分对不同细胞的凋亡作用。饶远权等发现人参皂苷Rg3 对肺腺癌NCI-H1650 细胞增殖具有明显的抑制作用,且呈时间剂量依赖关系。

1. 2 多糖类成分的示踪及体内代谢研究

多糖由于自身缺少发色基团和荧光基团,因此不能直接用紫外或荧光法进行检测.而利用化学修饰将 FITC 连接到多糖分子上,则可准确、灵敏的标记多糖,该方法是研究多糖在体内分布、降解和吸收的一种重要方法。胡锦珍等发现 FITC 荧光标记的壳聚糖(脱乙酰度为90%,相对分子质量为500kD) 给小鼠灌胃后在血清中质量浓度非常低,主要分布于肾脏,多数以原形经粪便排泄,部分分解的壳聚糖经尿液排泄。

王月慧等采用 FITC 标记 3 种相对分子质量(3,300~400,700 kD) 的壳聚糖,体外检测标记物的抑菌活性,发现标记后的壳聚糖依然具有抑菌活性,但因 FITC 标记时占据了壳聚糖的抑菌活性基团氨基,使抑菌活性减弱。陈忱等通过 FITC 与枸杞多糖的共价偶联,成功对枸杞多糖进行荧光标记,荧光取代度为1.3%,24 h 体外稳定性良好,为研究枸杞多糖的代谢动力学提供了良好的荧光探针。谢华通等采用凝胶色谱法观察 FITC 标记的麦冬多糖(MDG-1) 在大鼠胃肠道内的含量变化,结果表明,MDG-1 在胃内不分解,其主要代谢部位在肠道, 原因可能是肠道内环境及细菌共同作用的结果.

李福川等利用多糖具有的还原性末端, 通过对其半缩醛基的还原氨化反应先与酪胺( Tyr) 共价偶联,引入仲氨基,再与 FITC 进行亲核反应,完成对多糖的标记,实现了对海洋多糖 911 的选择性荧光标记。标记后的多糖抗凝活性无明显影响,也无明显的细胞毒性。康迪等也应用这一方法制备得到纯度达 99% 的 FITC-海胆黄多糖( SEP) 荧光标记物,并通过大鼠尾静脉注射后探索其血浆代谢情况。对于具有还原末端多糖及寡糖,这一标记方法通用型较强,且在虫草多糖、小刺猴头菌多糖、树舌灵芝多糖、黄芪多糖等多糖荧光标记物制备的体内代谢研究均有应用。

1. 3 药物载体的示踪研究

由于传统的药物载体不具备可观察性和可追踪性,造成载体检测比较困难,而将荧光纳米探针应用于药物载体可使该问题得到解决。采用 FITC 对载体颗粒进行修饰,制备复合荧光颗粒,依靠标准仪器检测,可高灵敏、高选择性地监测活细胞中的活性物质,现已在标记、示踪、检测等领域广泛应用。

杨丽等用 FITC 共价结合醋酸淀粉,制备得到一个荧光性质稳定、 具有生物可降解性的淀粉荧光纳米微粒。柳琳等制备的 FITC 标记的亲水性多肽类药物神经毒素自 组装核壳型纳米粒 ( NTSAN) 经鼻黏膜给药后,有助于提高 NT 的脑内浓度及生物利用度,为研究适宜蛋白质多肽类等大分子药物经鼻黏膜给药的脑靶向新剂型提供了参考。冯丽娜等制备了纳米药物载体 PAMAM-Ac-FITCLCTP,并将该载体与阿霉素连接, 经体内外实验观察到其对非小细胞肺癌 NCI-H460 具有良好的靶向性和缓释作用。刘鉴峰等制备的多肽介导的肿瘤靶向药物载体( G4-FITC-SP5-52) 在体外展示出良好的肿瘤靶向性. 高仕杰等用 FITC 标记的 TATPEG-阳离子脂质体,具备跨膜、长循环及荧光示踪功能,经尾静脉将其注入大鼠体内,可清晰显示标记物在 MCF-7 细胞内外的情况。

FITC 标记复合物还可作为荧光分子探针,用于外用药物传递系统研究.Heui Kyoung Cho 等用FITC 标记聚氧化乙烯-聚ε-己内酯-聚氧化乙烯共聚物(PEO-PCL-PEO),比较了未标记和标记后的共聚物在临界胶束浓度( CMC)、紫外吸收、荧光性能结晶等性质的差异,发现低 HLB 值的荧光标记物能克服角质层的屏障作用,渗入无毛小鼠肌肤深层。

主要参考资料

 [1]张雪梅,胡志宇.异硫氰酸荧光素在荧光标记领域的应用[J].昆明学院学报,2015,37(06):56-59.