(2S,3S)-(+)-2,3-丁二醇的制备

背景 ^[1][2]

2，3-丁二醇(2，3-butanediol，简称2，3-BD)作为一种非常有潜力的C4化学品，可以广泛应用于化工、食品、燃料以及航空航天等各个领域。2，3-丁二醇是一种极具价值的液体燃料，还可用来制备聚合物、油墨、香水、防冻剂、熏香剂、增湿剂、炸药以及药物的手性载体等。2，3-丁二醇的生产方法主要有化学法和微生物发酵法。

由于2，3-丁二醇结构的特殊性，化学法生产2，3-丁二醇原料消耗大、工艺路线复杂、建设投资大、对环境污染严重；而生物法制备2，3-丁二醇符合绿色化工和可持续性发展的要求，不过由于2，3-丁二醇的高沸点，高粘度、高亲水性等特点，2，3-丁二醇分离纯化难度较大，该过程一直是生物法制备2，3-丁二醇实现工业化的下游关键技术。由国内外研究现状可知，目前报道的有关2，3-丁二醇的分离纯化方法，2，3-丁二醇的分离效率和回收率都很低；工艺路线复杂，能耗高，无法实现工业化生产。

因此，开发符合从特定发酵液中提取2，3-丁二醇特点的、高效、节能、环保的工业化分离工艺流程尤为重要。由于2，3-丁二醇沸点高，且发酵液中含有易结焦杂质，直接采用蒸馏的办法提纯不仅能耗高、收率较低，而且纯化困难；同时，2，3-丁二醇具有极强的亲水性，与水精馏分离较为困难，因此需要加入能与水形成共沸物的溶剂精馏分离水；由此，发明人提出选用能与水形成低共沸物的萃取剂，从而可以在萃取后直接通过恒沸精馏分离水，降低后续精馏分离的能耗，简化分离流程。

针对2，3-丁二醇分离提取过程的特点，选用正丁醇作为萃取溶剂，从而可以通过共沸精馏在脱溶剂的同时从产品中脱除水，达到简化流程、降低后续精馏分离的能耗。对2，3-丁二醇-水-正丁醇三元液-液相平衡进行深入研究发现：正丁醇作为萃取剂时，分配系数较大、相比要求和理论级数较小，但液-液不互溶区域和可操作范围小。2，3丁二醇包含3个异构体(2R，3R)2，3丁二醇，(2S，3S)2，3丁二醇与meso2，3丁二醇。

结构

合成路线 ^[3][1][2]

国内外报道的有关2，3-丁二醇的分离纯化方法主要包括：(1)喷雾干燥法，即将高温惰性气体通入发酵罐，从而使可挥发性气体气化，由此分离2，3-丁二醇；(2)化学转化法，采用甲醛或丁醛与发酵液中的2，3-丁二醇反应，反应生成物经蒸馏、酸化处理回收2，3-丁二醇；(3)活性炭吸附法，包括活性炭吸附、丙酮或者二氧六环索氏萃取；(4)逆流汽提法，包括乙醇逆流汽提、过滤、精馏分离乙醇等过程；(5)溶剂萃取法，经pH值调节、加热、过滤、三效蒸发浓缩、正丁醇萃取、乙酸丁酯共沸精馏脱水、酯化、中和后得到2，3-丁二醇的二酯形式；(6)发酵-分离耦合法，包括渗透汽化、膜精馏、真空膜精馏、萃取等过程。

此外，国内还有一些合成方法。

1. 一种分离提取2，3-丁二醇的方法，包含步骤为，

(1) 首先，将发酵原液进行絮凝、过滤、膜分离过程后得到2，3-丁二醇滤液，2，3-丁二醇滤液与正丁醇的质量比为0.5∶1～1.5∶1，优选为0.5∶1～1∶1，在混合槽搅拌，使混合完全；

(2) 其次，将步骤(1)混合后得到的料液进入澄清槽中静置分层后，下层萃余液通过泵送回混合槽后继续进行萃取，上层萃取液进入精馏塔；

(3) 在精馏塔中萃取溶剂与水形成共沸精馏进入塔顶，塔顶产物一部分回流重新进入精馏塔，产物一部分采用蠕动泵将送回到混合槽中，继续对2，3-丁二醇水溶液进行萃取；所述的正丁醇既为萃取溶剂，也是后续共沸精馏的脱水溶剂；萃取溶剂和精馏溶剂为正丁醇；

(4) 经过不断萃取、精馏，2，3-丁二醇集中于塔釜；

(5) 当澄清槽水相中2，3-丁二醇质量浓度为1.6％～1.8％时，停止萃取、精馏循环操作；

(6) 最后，将塔釜液继续精馏，得到2，3-丁二醇产品液，2，3-丁二醇单次萃取率可达74％以上。

2. 一种由葡萄糖制备(2S,3S)-2,3-丁二醇与(3S)-乙偶姻的方法。具体步骤是： 

步骤1：制备生物催化剂，即：终浓度为70～100克细胞干重/升的肺炎克雷伯氏菌CICC 10011休止细胞 

(1)斜面培养：将肺炎克雷伯氏菌CICC 10011划线到固体培养基斜面上，37℃培养10～18小时。 

(2)种子培养：在无菌的条件下，用无菌接种环挑取步骤(1)斜面上的一环菌泥，接种到50毫升液体培养基中，37℃培养10～14小时。 

(3)发酵罐培养：在无菌的条件下，取步骤(2)所得培养液以体积比为5％的接种量接种到5升液体培养基中，37℃培养12～20小时。 

(4)收集菌体：将步骤(3)中得到的培养物8,000转/分离心10分钟，并用pH 7.0的磷酸缓冲液洗涤菌体两遍，然后将细胞重悬于pH 7.0的磷酸缓冲液中，使细胞的终浓度为70～100克细胞干重/升，即为生物催化剂，备用。

 其中，上述步骤(1)中所述固体培养基配方是：蛋白胨1.0克/升；牛肉膏1.0克/升；酵母粉0.5克/升；葡萄糖0.5克/升；乙酸钠0.3克/升；柠檬酸三铵0.2克/升；Tween 800.1克/升；K2HPO4·3H2O 0.2克/升；CaCO30.5克/升；MgSO40.02克/升；MnSO40.05克/升；琼脂1.5克/升，调pH为6.8～7.2，115℃灭菌20分钟。 上述步骤(2)～(3)中所述液体培养基配方是：葡萄糖80.0克/升；磷酸氢二铵6.0克/升；KCl 1.8克/升；MgSO4·7H2O 0.6克/升；EDTA 0.51克/升；FeSO4·7H2O 0.0225克/升；ZnSO4·7H2O 0.0075克/升；MnSO4·7H2O 0.0038克/升；柠檬酸0.21克/升；柠檬酸钠0.294克/升，调pH至7.0，115℃灭菌20分钟。 

步骤2：利用步骤1制备的肺炎克雷伯氏菌CICC 10011休止细胞生物催化剂制备(2S，3S)2，3丁二醇与meso2，3丁二醇的混合物 。其中：以菌体浓度为14～56克细胞干重/升的生物催化剂即肺炎克雷伯氏菌CICC 10011休止细胞，在37±2℃，pH 5.0～9.0条件下转化初始浓度为80～160克/升的葡萄糖，反应3～10小时后，得到含(2S，3S)2，3丁二醇与meso2，3丁二醇混合物的转化液；将所得转化液以8,000±500转/分离心10～15分钟，去除所加入的生物催化剂，收集上清液进行减压蒸馏，待水份完全蒸干后，馏分即为(2S，3S)2，3丁二醇与meso2，3丁二醇的混合物； 以气相色谱可测定上清液中(2S，3S)2，3丁二醇与meso2，3丁二醇的浓度。 

步骤3：再制备生物催化剂：终浓度为20～50克细胞干重/升的枯草芽孢杆菌ATCC 23857休止细胞 

(1)斜面培养：将枯草芽孢杆菌ATCC 23857划线到含有质量体积比为1.5％琼脂的固体培养基斜面上，37℃培养10～18小时。 

(2)种子培养：在无菌的条件下，用无菌接种环挑取步骤(1)斜面上的一环菌泥，接 种到50毫升液体培养基中，37℃培养10～14小时。 

(3)发酵罐培养：在无菌的条件下，取步骤(2)所得培养液以体积比为5％的接种量接种到5升液体培养基中，37℃培养12～20小时。 

(4)收集菌体：将步骤(3)中得到的培养物8,000转/分离心10分钟，并用pH 7.0的磷酸缓冲液洗涤菌体两遍，然后将细胞重悬于pH 7.0的磷酸缓冲液中，使细胞的终浓度为20～50克细胞干重/升，即为生物催化剂，备用。 其中，上述步骤(1)中所述固体培养基配方是：蛋白胨10.0克/升；牛肉膏8.0克/升；酵母粉4.0克/升；葡萄糖20.0克/升；乙酸钠5.0克/升；柠檬酸三铵2.0克/升；K2HPO4·3H2O2.0克/升；MgSO4·7H2O 0.2克/升；MnSO40.2克/升；琼脂15克/升，调pH至6.2，115℃灭菌20分钟。 上述步骤(2)～(3)中所述液体培养基配方是：葡萄糖70克/升；蛋白胨10克/升；酵母粉30克/升，调pH至7.0，115℃灭菌20分钟。 

步骤4：利用步骤(3)制备的枯草芽孢杆菌ATCC 23857休止细胞生物催化剂拆分步骤(2)中制得的(2S，3S)2，3丁二醇与meso2，3丁二醇的混合物，同时制备(2S，3S)2，3丁二醇与(3S)乙偶姻 

3. 一种生产手性纯(2S，3S)-2，3-丁二醇的方法，是将(2S，3S)-2，3-丁二醇脱氢酶基因在大肠杆菌中表达，并以此重组大肠杆菌全细胞为生物催化剂，以双乙酰和葡萄糖为底物转化生产手性纯(2S，3S)-2，3-丁二醇。本发明方法中参与菌株要求的培养基简单、成本低，并且生产过程及产物分离方便。生产的手性纯(2S，3S)-2，3-丁二醇最高产量可达到26g L-1以上，ee值大于99%，具有推广应用价值和可观的经济效益。

应用^[4]

2，3丁二醇各种异构体包括(2S，3S)2，3丁二醇是不对称合成中的重要原料，都是极具应用潜力的医药中间体。 手性二醇因具有两个手性中心而成为一种非常重要的手性化合物,它可作为合成精细化学品、手性药物、手性试剂等的手性砌块。其中,(2S,3S)-2,3-丁二醇在不对称合成含两个邻位手性中心的手性化合物中起重要作用。

主要参考资料

[1] CN200810202188.2 一种分离提取2,3-丁二醇的方法 

[2] CN201110247505.4 一种由葡萄糖制备(2S,3S)-2,3-丁二醇与(3S)-乙偶姻的方法 

[3]  CN201110021066.5 一种生产手性纯(2S,3S)-2,3-丁二醇的方法 

[4] 双酮还原酶的基因挖掘、表征与重组菌发酵优化研究