艾塞那肽的制备

背景及概述^[1][2]

胰高血糖素样肽-1(Glucagon like peptide-1，GLP-1)是肠道在食物尤其是碳水化合物刺激下分泌入血的一种肠促胰岛素，进入循环后通过特异性激动GLP-1 受体发挥作用，抑制餐后血糖的上升。在2 型糖尿病患者中，GLP-1 的分泌明显受损。天然GLP-1 入血后迅速被二肽基肽酶- Ⅳ（Dipeptidyl peptidase- Ⅳ，DPP- Ⅳ）降解（1~2min），不具有临床应用价值。

艾塞那肽(exenatide，AC2993) 是GLP-1 受体激动剂，为Exendin-4 的人工合成品，是一种新型的2 型糖尿病治疗药物。Exendin-4 是从钝尾毒蜥（Lizard Helodermasuspectum）唾液中分离出的一种多肽类激素，由39 个氨基酸残基组成，能够激动人类GLP-1 受体，在体内模拟GLP-1 的作用而且不易被DPP- Ⅳ降解，从而明显改善2 型糖尿病患者的血糖控制，同时伴有体重减轻。

需要指出的是，艾塞那肽是一种GLP-1 模拟剂（mimetic）而非类似物（analogue），它的氨基酸序列与哺乳动物GLP-1 重叠率仅为53%。艾塞那肽皮下注射剂于2005 年4 月获FDA 批准在美国上市，商品名为百泌达（Byetta），是首个通过FDA审批的GLP-1 受体激动剂。总而言之，作为一种具有明显的降糖效果，同时又不会引起体重增加反而可以降低体重，以及可能还具有多种心血管益处的新型降糖药物，艾塞那肽势必在今后的糖尿病治疗中占据重要的地位。

结构

适应症^[3]

用于和其他药物联合，如和双胍类或磺脲类等联用控制2型糖尿病的血糖。一般不用于1型糖尿病的治疗，也不能替代胰岛素的治疗。

规格^[3]

预装笔：每支1.2 ml，每剂5 μg，共60剂；或每支2.4 ml，每剂10 μg，共60剂。

用法用量^[3]

起始剂量为5 μg(mcg)，每日早餐和晚餐前60分钟大腿、腹部及上臂皮下注射2次，不应餐后应用。治疗1个月后，根据血糖可将剂量调至一日2次，每次10 μg。

药理作用^[1]

1. 促进胰岛素分泌及改善胰岛β 细胞功能

对13 例糖尿病患者及12 例健康志愿者静脉滴注艾塞那肽或生理盐水，以研究艾塞那肽对胰岛素分泌的作用。结果显示，糖尿病对照组时相(0 ～10 min) 胰岛素分泌缺乏，而糖尿病治疗组胰岛素分泌模式与健康志愿者类似，甚至第二时相(10～180 min) 胰岛素的分泌峰高于健康志愿者。

2. 抑制不恰当的餐后胰高血糖素分泌

研究发现，分别给予0.2，0.1μg/kg 艾塞那肽或安慰剂后，血浆胰高血糖素AUC0 ～ 3 h分别为186，218 和331 ng/（ h·L）（P ≤ 0.000 6)，艾塞那肽显著降低餐后胰高血糖素的分泌。

3. 延缓胃排空

在多项研究中应用口服对乙酰氨基酚的方法观察到艾塞那肽具有延缓胃排空的作用。研究发现：17 例糖尿病患者在治疗第5 天清晨给药后摄入含有99TC 标记鸡蛋和111In 标记液体的食物，观察到10 μg 组、5 μg 组和安慰剂组胃排空50% 内容物的时间（固体成分/ 液体成分）分别为：169/114 min，111/87min 和 60/34 min。值得注意的是，艾塞那肽的这一作用可能响口服药物的吸收，合并用药时，口服药物应在治疗作用的窗口期（如中午或睡前）服用。

药代动力学^[3]

皮下注射，达峰时间为2.1小时，平均t_1/2为2.4小时，体内持续10小时。模拟胰高血糖素样肽-1刺激葡萄糖依赖的胰岛素分泌和合成，促进β细胞新生和改善葡萄糖利用，抑制胰高血糖素分泌，延缓胃排空，减少摄食。

不良反应^[3]

主要不良反应有恶心、纳差、胃酸反流、呕吐、腹泻、腹部不适、头痛、紧张等。随用药时间延长可逐渐减少和减弱。少部分患者用药后可出现低血糖。

制备^[4]

步骤1：合成Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin

1）合成Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin

将Fmoc-Rink Amide MBHA Resin用N，N-二甲基甲酰胺溶胀后，用哌啶与N， N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液脱Fmoc-两次，加入N，N-二甲基甲酰胺、 Fmoc-Ser(tBu)-OH、1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸、N， N′-二异丙基乙胺，在氮气保护下，常温搅拌1～3小时，得到Fmoc-Ser(tBu)-MBHA  Resin。

2）合成Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin

将Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin用哌啶与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为1:的混合液脱Fmoc-两次，加入N，N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Pro-OH、1-羟基苯丙三唑、 苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸、N，N′-二异丙基乙胺，在氮气保护下，常 温搅拌1～3小时，得到Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin。

3）合成Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin

按照步骤（2）的方法向Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin上依次连接Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH，得到Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro- Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin。

步骤2：合成Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-COOH

1）合成Fmoc-Gly-2-CTC resin

将2-chlorotrityl chloride resin用二氯甲烷溶胀后，加入二氯甲烷、Fmoc-Gly-OH、 N，N′-二异丙基乙胺，在氮气保护下，常温搅拌1～3小时，得到Fmoc-Gly-2-CTC resin。

2）合成Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-2-CTC resin

按照步骤1中（2）的方法，向Fmoc-Gly-2-CTC resin上依次连接Fmoc-Asn(Trt)- OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH，得到Fmoc-Lys(Boc)- Asn(Trt)-Gly-2-CTC resin。

3）切割处理

向Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-2-CTC resin中加入切割液，常温搅拌1～3小时， 过滤，将滤液加入冷乙醚中，析出沉淀，得到Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-COOH。上述的切割液是三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1:99或2:98的混合液，或者 是三氟乙醇与乙酸、二氯甲烷的体积比为2:1:7的混合液。

步骤3：合成Fmoc-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH

按照步骤2中（1）的方法，向2-chlorotrityl chloride resin上连接Fmoc-Leu-OH， 得到Fmoc-Leu-2-CTC resin，再按照步骤2中（2）的方法向Fmoc-Leu-2-CTC resin 上依次连接Fomc-Trp-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fomc-Val-OH，得到Fmoc-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe -Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-2-CTC Resin，Fmoc-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp- Leu-2-CTC Resin按照步骤2中（3）的方法进行切割处理，得到Fmoc-Val-Arg(pbf) -Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)- Trp-Leu-COOH。

步骤4：合成Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-COOH

按照步骤2中（1）的方法，向2-chlorotrityl chloride resin上连接Fomc-Ala-OH， 得到Fmoc-Ala-2-CTC resin，再按照步骤2中（2）的方法向Fmoc-Ala-2-CTC resin 上依次连接Fomc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fomc -Met-OH，得到Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-2-CTC Resin，Fmoc- Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-2-CTC Resin按照步骤2中（3）的方法进行 切割处理，得到Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-COOH。

步骤5、合成Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)- Gln(Trt)-COOH

按照步骤2中（1）的方法，向2-chlorotrityl chloride resin上连接Fomc-Gln(Trt) -OH，得到Fmoc-Gln(Trt)-2-CTC resin，再按照步骤2中（2）的方法向Fmoc-Gln(Trt) -2-CTC resin上依次连接Fomc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fomc-Thr(tBu)-OH，得到Fmoc-Thr(tBu)- Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-2-CTC Resin，Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu) -Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-2-CTC Resin按照步骤2中3）的方法进行切 割处理，得到Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH。

步骤6：合成Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-COOH

按照步骤2中（1）的方法，向2-chlorotrityl chloride resin上连接Fomc-Phe-OH， 得到Fmoc-Phe-2-CTC resin，再按照步骤2中（2）的方法向Fmoc-Phe-2-CTC resin 上依次连接Fomc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、 Fomc-His(Trt)-OH，得到Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-2-CTC ResinFmoc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-2-CTC Resin按照步骤2中（3）的方 法进行切割处理，得到Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-COOH。

步骤7：合成艾塞那肽

1）组装连接Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala- Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin

将步骤1得到的Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Se r(tBu)- MBHA Resin用哌啶与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液脱Fmoc-两次， 加入N，N-二甲基甲酰胺与二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮的体积比为0.5～1:1～2:1的 混合液以及Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-COOH、1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N， N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸、N，N′-二异丙基乙胺，在氮气保护下，常温搅拌3～4 小时，得到Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro- Ser(tBu)-MBHA Resin。

2）组装连接艾塞那肽

按照步骤（1）的组装连接方法，向Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(t Bu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin上依次组装连接Fmoc-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH、Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-COOH、Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH、Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-PheCOOH，用哌啶与N，N-二甲 基甲酰胺的体积比为1:4的混合液脱Fmoc-两次，得到艾塞那肽树脂。

用质量百分 比组成为三氟乙酸83%、苯酚5%、苯甲硫醚4%、水3%、三异丙基硅烷5%的切 割液按照步骤（2）中③的方法对艾塞那肽树脂进行切割处理，得到艾塞那肽粗品， 艾塞那肽粗品经反相色谱纯化、冷冻干燥，得到艾塞那肽。

主要参考资料

[1] 曾梅芳, 叶红英, 李益明. 降糖新药艾塞那肽临床研究进展[J]. 上海医药, 2010, 31(12): 535-538. 

[2] 王慧, 张忠旗, 赵金礼, 等. 艾塞那肽的合成[J]. 化学与生物工程, 2018 (2018 年 02): 54-58.

[3] 临床实用药物手册

[4] 张忠旗；王慧；张腾；景山岗；韩彬；杨晓琳.一种艾塞那肽的固相片段合成方法. CN201310593381.4，申请日 20131120