酚试剂的应用

背景及概述^[1]

 酚试剂是一种常用的测定蛋白质试剂，与蛋白质的呈色反应包括二步：步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜复合物;第二步是蛋白质-铜复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比。此法是生化工作领域内较广泛应用的一种蛋白质浓度测定的方法。优点是操作简便，灵敏度高，可测25～250μg蛋白质;缺点是该试剂只与蛋白质中酪氨酸、色氨酸起反应，因此有蛋白质特异性影响，即不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同，标准曲线也不是严格直线。

应用^[2-3]

 应用一：

现有的对空气中甲醛含量的测定方法，多利用一些列酶与甲醛发生的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长处吸光度上升的程度，从而测算出甲醛的浓度大小。这些方法中所选酶系复杂，具有一定的检测成本，且计算过程相对保密，限制了使用范围。并且其精确度较低，属于定性测量，限制测定的场所。针对现有技术中的不足，利用酚试剂比色法来测定空气中甲醛含量，灵敏度高，选择性好，操作简便。

技术方案为：一种空气中甲醛含量测定方法，利用不同浓度的甲醛与酚试剂反应生成嗪，采用酚试剂比色法绘制标准曲线，然后在硫酸铁铵的高铁离子存在下，嗪在酸性溶液中被高铁离子氧化形成蓝绿色化合物，根据颜色深浅，比色测定得出空气中甲醛含量，具体包括以下步骤：

(1)采样：采样前，被采样房间必须密闭24小时，采样需在风平浪静气候环境下进行，用一个内装5毫升吸收液的大型气泡吸收管，以0.5升/分流量，采气10升；

(2)标准曲线的绘制：取8支10毫升的比色管，按照下表配制标准色列：

在各管中加入0.40毫升1％硫酸铁铵溶液，摇匀，放置15分钟后，用1厘米的比色皿，于波长630纳米处，以水为参比，测定吸光度，以吸光度对甲醛含量(微克)，绘制标准曲 线，或用最小二乘法计算标准曲线的回归方程式：

Y＝bX+a——(a)

(a)式中：

Y—(A-A0)，即标准溶液吸光度(A)与试剂空白液吸光度(A0)之差；

X—甲醛含量，微克；

b—回归方程式的斜率；

a—回归方程式的截距，

(3)样品测定：采样后，将样品溶液移入比色管中，用少量吸收液洗涤吸收管，洗液 并入比色管使总体积为5毫升；

(4)、数据处理，按照下式计算甲醛溶液的浓度C，单位：毫克/毫升，

(b)式中：

A—样品溶液吸光度；

A0—试剂空白液吸光度；

b—回归方程式的斜率；

a—回归方程式的截距；

Vr—换算为参比状态下的采样体积，单位为升。

应用二：

目前，检测蛋白质常用的方法有凯氏定氮法、自动定氮仪法、双缩脉法，通过同时 对饲料中的粗蛋白质进行测定，并对结果进行了分析比较，结果表明：凯氏定氮法测定所用的时间较长，测得结果比较稳定；自动定氮仪同国标法相比，结果偏高，相对偏差较小，但实 验成本高；双缩脉法测定结果偏低，偏差较大，但操作简单，效率高，更适合饲料厂等企业的快速测定。因此，这些缺点使得以上方法均无法满足企业实际生产的需要。酚试剂可用于提供一种牧草饲料中蛋白质的检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

检测步骤如下：

（1）称取牧草饲料粉碎，放入烧瓶中，加入氢氧化钠溶液，放入60℃的水浴中5h进行反 应，取出摇匀，加入蒸馏水稀释40倍，离心5min，静置；

（2）取上清液放入试管中，加入酚试剂甲液，混合均匀，于38℃恒温水浴中放置20min；再加入酚试剂乙液，立即振荡混合均匀，在38℃恒温水浴中保温30min，用1cm光径比色皿在750nm波长下测定吸光度，并根据测定结果与标准曲线对比得到样品蛋白质含量。

标准曲线的建立如下：

（1）试剂配制

标准蛋白溶液0.10mg/mL；

酚试剂甲液：将3％碳酸钠溶液、0.2mol/L氢氧化钠溶液、0.01％五水硫酸铜溶液、0.02％柠檬酸钾溶液等体积混合，该溶液当天配制当天使用；

酚试剂乙液：配制浓度为2.5％的钼酸钠溶液，与体积分数为85％的浓磷酸进行反应，加入硫酸锂和溴化氢，稀释5倍，过滤后，保存在棕色瓶中；使用时前进行标定；

（2）曲线制作

取8支试管，加入不同量的标准蛋白和蒸馏水混匀后，每管加入4mL酚试剂甲液，混匀，于38℃下放置20min；再加入0.4mL酚试剂乙液，立即振荡混匀，在38℃下保温30min，用1cm光径比色皿在750nm下测定吸光度；以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

主要参考资料

[1]常用中药词语词典

[2]CN201710579528.2

[3] CN201610949713.1