紫草提取物的制备方法及其应用

背景技术

肿瘤疾病已经成为威胁人类健康和生命的主要敌人之一，其发病率和死亡率都在逐年上升。死亡率仅次于心血管病，是人类的第二大杀手。如何通过有效措施防治恶性肿瘤已成为我国以至全世界防治疾病的首要任务，也是全社会特别是医学领域急待解决的重大课题。但由于癌症早期诊断的困难，相当数量的癌症患者将依赖药物治疗，因此，抗肿瘤药物的研发与应用是生物医药科学迅速发展的一个重要领域。

宫颈癌是最常见的妇性生殖道恶性肿瘤之一，在我国宫颈癌的发生占女性生殖道恶性肿瘤的位。不但在女性生殖器官癌瘤中占首位而且是女性各种恶性肿瘤中最多见的癌瘤。卵巢癌是一类很难被早期发现的癌症，是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，占妇科癌肿的4%以上，其死亡率居妇科肿瘤首位，发病率占第三位，次于宫颈癌和宫体癌。卵巢癌的发病率近年来不断上升，对女性健康危害极大。近三十年来，妇科癌瘤的治疗取得了长足的进展，但唯独卵巢癌的疗效尚无明显改善。胰腺癌是一种恶性程度很高的消化道常见肿瘤，其发病机制尚不明确，在恶性肿瘤中胰腺癌的发病率和死亡率都较高。胰腺癌具有高度恶性的生物学行为，临床经过凶险，5年生存率很低，在60余种恶性肿瘤中，预后最差。

中医药治疗肿瘤与西医治疗肿瘤相比有其独特的优势，中医药在肿瘤诊治上有十分丰富的理论和临床经验。中药由于成分复杂，通过发挥多层次、多环节、多靶点的综合作用而抗肿瘤。中医在治疗肿瘤思路上充分利用中药多靶点作用并结合中医理论从整体观出发对机体进行整体调节。中药有着良好的研究开发前景，从中草药中寻找抗肿瘤有效成分治疗恶性肿瘤目前已越来越被广大学者与患者所接受，并己成为常用的治疗方法，是恶性肿瘤综合治疗中的有效手段之一。

发明内容

本发明的目的是公开一种紫草提取物的制备方法及其在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

本发明一种紫草提取物的制备方法，按以下步骤进行:

一、制备紫草粉末:将紫草置于温度为40°C~50°C的条件下烘干，得到干燥的紫草，然后粉碎成粉末，过I号筛，保留筛下，得到紫草粉末；

二、利用CO2超临界萃取技术对步骤一得到的紫草粉末进行以萘醌类成分为主的有效部位的提取:将步骤一得到的紫草粉末装入萃取釜中，将萃取釜加热至40°C~50°C、解析釜加热至40°C~50°C、贮罐加热至30°C~40°C，然后开启CO2瓶，控制CO2流量为20L/h~30L/h，通过高压泵对系统进行加压，当萃取釜的萃取压力为15MPa~20MPa、解析釜的解析压力为4MPa~SMPa时，开始循环萃取，并保持萃取釜恒温恒压，当萃取2h~3h后，从解析釜出料口出料，即得到深红色的浓膏状紫草提取物。[0009] 本发明一种紫草提取物的应用，是紫草提取物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

本发明的优点:

一、本发明提供了一种紫草提取物的制备方法，以紫草为原料，利用二氧化碳超临界萃取技术对其进行以萘醌类成分为主的有效部位的进行高效的富集，提取、纯化工艺，超临界流体萃取法与传统的化学溶剂提取法相比，其优越性是无化学溶剂残留，无污染，避免提取物高温热裂解，保护生理活性物质的活性且工艺简单，提取效率高且纯度高，有利于工业生产；

二、本发明采用四因素一三水平正交设计，以含量和提取量为指标，用CO2超临界流体萃取技术对中药紫草中的萘醌类成分的萃取条件进行了优化选择，得出紫草中萘醌类成分的萃取条件为:萃取压力17MPa、萃取温度40°C、解析压力5MPa、解析温度40°C、流量25L/h ;经过分光光度法以紫草素测定提取物中总萘醌类成分含量的方法学考察表明，其精密度、稳定性、重现性和加样回收率的相对标准偏差均小于3%，说明此方法准确、可靠；应用已建立的HPLC含量测定方法对有效部位群中乙酰紫草素等4种主成分进行测定，经计算，四种成分的总含量为58.42 + 6.15%，占总萘醌含量的87.30 + 3.22% ；

三、本发明通过体外活性筛选实验来证实其抗肿瘤活性作用，研究结果表明，紫草有效部位可诱导多种肿瘤细胞凋亡；紫草有效部位可抑制人子宫颈鳞癌细胞Siha、人卵巢癌细胞Skov3、人胰腺癌细胞Bxpc3、人宫颈癌细胞Hela、人卵巢癌细胞Ηο_8910、人肝癌细胞H印G2的细胞生长，并呈剂量和时间依赖性，表明紫草有效部位对多种肿瘤均有较强的细胞毒活性，48h紫草提取物对六种细胞的IC50值均小于0.9ug/ml ;药理研究发现紫草有效部位具有抗肿瘤作用，证明其对人6种肿瘤细胞的生长均有抑制作用，并呈明显的量效关系，为探索高效且经济的天然抗肿瘤药物提供了实验依据。

四、本发明着重以妇科肿瘤和消化道细胞株为研究对象，证实紫草萘醌类有效部位对肿瘤细胞系具有确切的抑制 生长诱导凋亡的生物活性，为将硬紫草及其萘醌类有效部位开发成疗效卓越、靶点明确的的抗癌新药提供科学的实验基础，为妇科癌和消化道癌症的临床治疗采用合理的方案提供理论依据和科学的实验数据。

具体实施方式

具体实施方式一:本实施方式一种紫草提取物的制备方法，按以下步骤进行:

一、制备紫草粉末:将紫草置于温度为40°C~50°C的条件下烘干，得到干燥的紫草，然后粉碎成粉末，过I号筛(2000±70 ym，10目)，保留筛下，得到紫草粉末；

二、利用CO2超临界萃取技术对步骤一得到的紫草粉末进行以萘醌类成分为主的有效部位的提取:将步骤一得到的紫草粉末装入萃取釜中，将萃取釜加热至40°C~50°C、解析釜加热至40°C~50°C、贮罐加热至30°C~40°C，然后开启CO2瓶，控制CO2流量为20L/h~30L/h，通过高压泵对系统进行加压，当萃取釜的萃取压力为15MPa~20MPa、解析釜的解析压力为4MPa~SMPa时，开始循环萃取，并保持萃取釜恒温恒压，当萃取2h~3h后，从解析釜出料口出料，即得到深红色的浓膏状紫草提取物。

本实施方式步骤一中所述的紫草为紫草科植物紫草(Lithospermumerythrorhizon sieb.et Zucc)的干燥根,亦称硬紫草；紫草中主要成分为萘醌类成分,经试验证明紫草中萘醌类成分具有对热不稳定性，紫草素在加热60°C以上颜色由红色变成紫黑色，随温度升高变化速度加快，薄层色谱法检查斑点消失，提示紫草色素被破坏。

本实施方式提供了一种紫草提取物的制备方法，以紫草为原料，利用二氧化碳超临界萃取技术对其进行以萘醌类成分为主的有效部位的进行高效的富集，提取、纯化工艺，超临界流体萃取法与传统的化学溶剂提取法相比，其优越性是无化学溶剂残留，无污染，避免提取物高温热裂解，保护生理活性物质的活性且工艺简单，提取效率高且纯度高，有利于工业生产。

本实施方式采用四因素一三水平正交设计，以含量和提取量为指标，用CO2超临界流体萃取技术对中药紫草中的萘醌类成分的萃取条件进行了优化选择，得出紫草中萘醌类成分的萃取条件为:萃取压力17MPa、萃取温度40°C、解析压力5MPa、解析温度40°C、流量25L/h ;经过分光光度法以紫草素测定提取物中总萘醌类成分含量的方法学考察表明，其精密度、稳定性、重现性和加样回收率的相对标准偏差均小于3%，说明此方法准确、可靠；应用已建立的HPLC含量测定方法对有效部位群中乙酰紫草素等4种主成分进行测定，经计算，四种成分的总含量为58.42 + 6.15%，占总萘醌含量的87.30 + 3.22% ；

本实施方式通过体外活性筛选实验来证实其抗肿瘤活性作用，研究结果表明，紫草有效部位可诱导多种肿瘤细胞凋亡；紫草有效部位可抑制人子宫颈鳞癌细胞Siha、人卵巢癌细胞Skov3、人胰腺癌细胞Bxpc3、人宫颈癌细胞Hela、人卵巢癌细胞Ho-8910、人肝癌细胞HepG2的细胞生长，并呈剂量和时间依赖性，表明紫草有效部位对多种肿瘤均有较强的细胞毒活性，48h紫草提取物对六种细胞的IC50值均小于0.9ug/ml ;药理研究发现紫草有效部位具有抗肿瘤作用，证明其对人6种肿瘤细胞的生长均有抑制作用，并呈明显的量效关系，为探索高效且经济的天然抗肿瘤药物提供了实验依据。

本实施方式着重以妇科肿瘤和消化道细胞株为研究对象，证实紫草萘醌类有效部位对肿瘤细胞系具有确切的抑制生长诱导凋亡的生物活性，为将硬紫草及其萘醌类有效部位开发成疗效卓越、靶点明确的的抗癌新药提供科学的实验基础，为妇科癌和消化道癌症的临床治疗采用合理的方案提供理论依据和科学的实验数据。