菜豆凝集素(PHA)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

菜豆凝集素(PHA)ELISA KIT采用双抗体夹心ABC-ELISA法特异性检测样本中菜豆凝集素(PHA)的含量。菜豆凝集素(PHA)是一种能使动物红细胞凝集的蛋白质,是莱豆中毒主要的致毒物。

实验原理：用抗菜豆凝集素PHA单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的PHA与单抗结合，加入生物素化的抗菜豆凝集素PHA，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，PHA浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中PHA浓度。

菜豆凝集素(PHA)ELISA KIT

操作步骤：

1、加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品*终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

2、温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

3、配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用

4、洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此

重复5次，拍干。

5、加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

6、显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色

10分钟.

7、终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

8、测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

应用^[4][5]

用于菜豆植物凝集素的遗传多样性及候选基因关联分析研究

以364份菜豆品种为试验材料,采用改进的血凝法测定鲜荚中的PHA含量并进行遗传多样性分析。

同时,对不同品种不同发育时期的豆荚、荚壁和种子中的PHA含量进行测定,研究PHA含量的变化规律。另一方面,以150份菜豆品种为试验材料,基于PHA候选基因,对PHA基因在不同菜豆品种中的核苷酸多态性与PHA含量进行关联分析,挖掘出功能性SNP位点。

试验结果表明:1.两年度的菜豆种质中PHA含量变幅为0.0041.949mg/g,变异系数为0.545,PHA含量平均水平在0.653mg/g左右。菜豆品种间的PHA含量水平差异极显著,表现出明显的种质特异性和遗传多样性。

PHA含量在两个年度的菜豆种质中整体表现较为一致,PHA含量极高和极低的种质资源数量极少。菜豆种质按PHA含量根据聚类分析结果可分为三类,且大部分菜豆种质（第Ⅱ类）的PHA含量属于中等PHA含量（0.5000.999 mg/g）。

2.8个菜豆品种‘17号’‘宏富’‘热那亚’‘A18-1-2’‘银白条’‘十粒长’‘紫冠’与‘白珍珠’在不同发育阶段的PHA含量有显著性差异,但随着豆荚生长发育都呈现出相同的趋势,且都在花后14天出现峰值。菜豆的生长发育过程中,‘紫冠’与‘白珍珠’在豆荚、荚壁与种子中的PHA含量存在着一定的差异,且‘紫冠’PHA含量在豆荚、荚壁和种子中均低于‘白珍珠’。

‘紫冠’和‘白珍珠’的PHA基因的表达量与PHA含量随着生长发育呈现出相同的趋势,出现‘双峰’现象,且‘白珍珠’的PHA基因表达量在多个阶段皆高于‘紫冠’。

3.通过对PHA候选基因的60个SNP位点与PHA含量进行关联分析,发现位点PV14与PHA含量极显著关联。位点PV14为G/G基因型表现为PHA含量为中低水平。在20个品种中有7个品种的PHA含量属于中等水平,低PHA含量品种有13个。C/C基因型所对应的PHA含量要显著的高于G/G基因型。因此位点PV14可用作菜豆育种工作中针对PHA含量类型的重要标记之一。

参考文献

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[5]胡燕秋.菜豆植物凝集素的遗传多样性及候选基因关联分析[D].黑龙江大学,2020.