LC3B抗体的应用

背景^[1-3]

LC3B抗体用人工合成的LC3B氨基端的一段多肽进行适当修饰后免疫兔子，然后用protein A和抗原多肽亲和柱经过两步纯化得到的高纯度抗体。

LC3B抗体识别的是总LC3B(total LC3B)，可以检测内源性的LC3B，可以同时识别LC3B-I和LC3B-II，分子量依次分别为16kD和14kD。

自噬(Autophagy)是一种最终通过溶酶体(lysosome)降解部分细胞自身组份的的分解代谢过程。自噬通常会在营养缺乏的情况下被激活，同时又与许多生理病理过程相关，包括生长、分化、神经退行性疾病、感染和肿瘤等。LC3(light chain 3)是目前公认的自噬分子标记物(autophagy marker)。

LC3B免疫组化

LC3最初发现时被认为是微管关联蛋白1A和1B(microtubule-associated proteins 1A and 1B)，被称为MAP1LC3，随后发现LC3与酵母蛋白Apg8/Aut7/Atg8具有较高相似性，并在自噬过程中起重要作用。哺乳动物中有三种LC3，包括LC3A、LC3B和LC3C，它们在自噬过程中存在相关的翻译后修饰。

LC3蛋白首先会在合成后立即在其羧基端被Atg4所剪切，产生细胞浆定位的LC3-I。在自噬过程中，LC3-I会被包括Atg7和Atg3在内的泛素样体系所修饰和加工，产生分子量为14kD的LC3-II，并定位到自噬小体中。

这样自噬小体中存在的LC3，和低分子量的LC3-II都被当做细胞发生自噬的分子标志(autophagy marker)，并且LC3-II的含量和发生自噬的程度成正比。LC3B作为LC3的一种，同样可以用作自噬的分子标志。

应用^[4][5]

用于低氧促进胶质母细胞瘤自噬和侵袭迁移过程中相关microRNAs的作用机制研究

进一步实验室验证并明确能够显著影响低氧下胶质母细胞瘤细胞自噬和侵袭迁移的miRs。

方法：（1）低氧处理、RNA提取和基因芯片检测将低氧处理24h的U251细胞与常氧组对照分别提取总mRNA和总microRNA,通过全基因表达谱和全microRNA表达谱的检测,获取详细结果分析报告和原始数据。

（2）两组芯片数据的联合分析和靶点预测筛选经检测芯片数据及样本同质性均较好,使用火山图（Volcano Plot）法筛选出低氧条件下胶质母细胞瘤中表达量变化具有显著性差异的基因和miR s。然后,结合全基因组表达谱芯片报告中的通路分析（P athway Analysis）和GO分析（Gene Ontology Project Analysis）结果以及大量文献阅读,将筛选出的差异性基因和miRs进行关联分析,并进行功能分类,进一步缩小研究范围,找出最有可能调控胶质母细胞瘤自噬和侵袭迁移的miRs。

（3）实验室验证所筛选靶点首先,使用多种胶质母细胞瘤细胞系（U251、T98G、U87和A172）进行低氧培养,对筛选出的低氧下变化显著的部分miRs进行实时定量PCR验证。然后,向低氧培养的U251细胞系中瞬时转染相应的microRNA inhibitor和mimics,对通过验证的miRs进行敲除和过表达,分别利用Western blot法、实时定量PCR法、和Transwell法检测上述U251细胞内自噬标记蛋白LC3B分子的表达水平、自噬相关miRs的表达水平、以及迁移能力变化

参考文献

[1]Glioblastoma multiforme:Pathogenesis and treatment[J].Constantinos Alifieris,Dimitrios T.Trafalis.Pharmacology and Therapeutics.2015

[2]Toward an effective strategy in glioblastoma treatment.Part I:resistance mechanisms and strategies to overcome resistance of glioblastoma to temozolomide[J].Khaled Messaoudi,Anne Clavreul,Frédéric Lagarce.Drug Discovery Today.2015(7)

[3]Dendritic Cell-Based Immunotherapy Treatment for Glioblastoma Multiforme[J].Liu Yang,Geng Guo,Xiao-yuan Niu,Jing Liu,Yung-Fu Chang.BioMed Research International.2015

[4]Confinement and Low Adhesion Induce Fast Amoeboid Migration of Slow Mesenchymal Cells[J].Yan-Jun Liu,Ma?l Le Berre,Franziska Lautenschlaeger,Paolo Maiuri,Andrew Callan-Jones,Mélina Heuzé,Tohru Takaki,Rapha?l Voituriez,Matthieu Piel.Cell.2015(4)

[5]薛皓.低氧促进胶质母细胞瘤自噬和侵袭迁移过程中相关microRNAs的作用机制研究[D].山东大学,2016.