病毒RNA纯化试剂盒的应用

背景^[1-3]

病毒RNA纯化试剂盒采用可以特异性结合病毒RNA的吸附柱和独特的缓冲液系统，适用于从血清、血浆、尿液、脑脊液等无细胞体液及细胞培养上清液中分离病毒RNA。病毒RNA特异性地结合到硅基质膜上，而污染物则流过该膜。通过两次高效洗涤完全去除蛋白质等杂质，然后用无RNase的水或试剂盒提供的RNase-Free Water洗脱高纯度的病毒RNA。由本试剂盒提取的病毒RNA可直接用于RT-PCR、Real-time RT-PCR和印迹分析等实验。

病毒RNA纯化试剂盒

操作步骤：

1、室温下取200μl血清或血浆加到1.5ml离心管(自备)中。

2、向上步溶液中加入20μl蛋白酶K，混匀。

3、加入200μl Buffer GL，涡旋震荡15秒。

4、56℃孵育15分钟，短暂离心，将管壁上的溶液收集到管底。

5、加入250μl无水乙醇，涡旋震荡15秒，室温孵育5分钟，短暂离心，将管壁上的溶液收集到管底。

6、将步骤5得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，若一次不能将全部溶液加入吸附柱中，请分两次转入，12000rpm(~～13400×g)离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

7、向吸附柱中加入500μl Buffer RW1，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

8、向吸附柱中加入500μl Buffer RW2(使用前检查是否加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

9、向吸附柱中加入500μl无水乙醇，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

10、12000rpm离心3分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。

11、将吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入20-50μl RNase-Free Water，室温放置5分钟，12000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。

应用^[4][5]

用于动物RNA病毒反向遗传系统的研究和建立研究

SVDV HK／70株生物特性测定、生物信息学分析及以T7 RNAP为基础的体外病毒拯救方法的建立和应用为了建立以T7 RNA聚合酶系统为基础的体外拯救病毒方法，选择猪水泡病病毒（SVDV）HK／70株作为细胞质复制的RNA病毒的研究模型。

首先，分离和鉴定了该病毒，并测定了该病的一些生物学特性。然后构建了SVDV全长cDNA并进行序列测定，以此为基础，分析了其相关生物信息学特征。为了鉴定SVDV HK／70株的全长cDNA分子的感染性，以线化的SVDV HK／70株的全长cDNA质粒(pSVOK12)为模板，应用T7 RNA聚合酶系统在体外进行转录，将获得的RNA用脂质体转染法导入IBRS-2细胞，传代培养，可以观察到典型的SVDV致细胞病变效应。

使用反向血凝鉴定试验、间接免疫荧光实验、RT-PCR和序列测定进行检测，结果表明，从猪水泡病病毒全长cDNA拯救出了猪水泡病病毒（G-SVDV）；利用常规负染的方法，电镜观察了G-SVDV的形态；测定了G-SVDV的TCID50和LD50，并与亲本毒进行了比较，结果显示G-SVDV与亲本毒的毒力差别不显著。

参考文献

[1]Rescue of the prototypic Arenavirus LCMV entirely from plasmid[J].Ana B.Sánchez,Juan C.de la Torre.Virology.2006(2)

[2]An efficient helper-virus-free method for rescue of recombinant paramyxoviruses and rhadoviruses from a cell line suitable for vaccine development[J].Susan E.Witko,Cheryl S.Kotash,Rebecca M.Nowak,J.Erik Johnson,Lee Anne C.Boutilier,Krista J.Melville,Sannyu G.Heron,David K.Clarke,Aaron S.Abramovitz,R.Michael Hendry,Mohinder S.Sidhu,Stephen A.Udem,Christopher L.Parks.Journal of Virological Methods.2006(1)

[3]Infective viruses produced from full-length complementary DNA of swine vesicular disease viruses HK/70 strain[J].Haixue Zheng,Xiangtao Liu,Youjun Shang,Jinyan Wu,Xingwen Bai,Ye Jin,Shiqi Sun,Huichen Guo,Hong Tian,Xia Feng,Shuanghui Yin,Jianhong Guo,Guozheng Cong,Zaixin Liu,Huiyun Chang,Junwu Ma,Qingge Xie.Chinese Science Bulletin.2006(17)

[4]The clearance of viruses and transmissible spongiform encephalopathy agents from biologicals[J].Mahmood Farshid,Rolf E Taffs,Dorothy Scott,David M Asher,Kurt Brorson.Current Opinion in Biotechnology.2005(5)

[5]郑海学.动物RNA病毒反向遗传系统的研究和建立[D].中国农业科学院,2007.