人颅骨成骨细胞的应用

背景^[1-3]

人颅骨成骨细胞提取于人颅骨组织，原代冻存。细胞通过对AP和mineral deposition的细胞化学验证，经测试不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。

人颅骨成骨细胞

成骨细胞(osteoblast，OB)主要由内外骨膜和骨髓中基质内的间充质始祖细胞分化而来，能特异性分泌多种生物活性物质，调节并影响骨的形成和重建过程。

成骨细胞的来源主要有骨、骨膜、骨髓及骨外组织。及人的胚胎颅骨或新生动物的颅骨为成骨细胞的常用来源。Robey(1985)采用胶原酶处理松质骨骨块以除去结缔组织和骨髓造血组织，再将处理过的骨块进行培养来获得更纯净的成骨细胞。

将人胚胎颅骨中所获得的成纤维样细胞通过加入β-甘油磷酸钠诱导分化后培养3周，可见细胞基质钙化，表明所得细胞为具有很强分化能力的成骨细胞。将以乙二胺四乙酸和胶原酶消化胎儿颅骨获得的细胞进行体外培养，发现其在人工材料上能持续增殖20倍以上，且具有高ALP活性。

取人松质骨建立成骨细胞体外培养模型并得到了大量纯化的成骨细胞。选用成年雌性大鼠松质骨在较短时间内得到较多数量的成骨细胞。

骨膜中的细胞早已被证实在适当的条件下可形成骨和软骨。Vacanti等(1993)从新生小牛肩胛骨骨膜中分离出成骨细胞并种植到多孔聚羟乙酸支架上，7～10d后成骨细胞发生增殖。

用胶原酶短时预消化法从取自新西兰兔胫骨上端内侧面骨膜上短时间内得到高纯度的成骨细胞。骨髓分造血和基质两大系统，其成骨能力来源于基质。张银刚等(2000)采用胎兔长管骨骨髓细胞进行体外培养，证明其有骨细胞系特性，可作为修复骨缺损的种子细胞。

应用^[4][5]

用于成骨细胞特异性识别多肽对人成骨细胞增殖和矿化影响的实验研究

探讨人成骨细胞特异性识别多肽对人成骨细胞增殖和矿化功能的影响,摸索并确定成骨细胞特异性识别多肽体外促进人成骨细胞增殖矿化的有效浓度,为该特异性多肽的进一步研究及应用提供实验基础。

具体研究内容和结果如下:部分:MTT法检测人成骨细胞的增殖体外常规培养人颅骨成骨细胞,用α-MEM培养基将成骨细胞特异性识别多肽配制成五种不同的浓度,分为5个实验组（10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol/L）以及空白对照组,分别于4,7 d进行MTT检测,获得的实验数据进行统计学分析。结果表明:在此浓度范围的成骨细胞特异性识别多肽能促进人颅骨成骨细胞的增殖（P<0.05）,其有效作用浓度是10-5mol/L。

第二部分:碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性检测体外常规培养人颅骨成骨细胞,用α-MEM培养基将成骨细胞特异性识别多肽配制成五种不同的浓度,分为5个实验组（10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol/L）以及空白对照组,分别于第4、7 d取出细胞,按照ALP检测试剂盒以及BCA蛋白法步骤进行检测。将ALP活性除以测得的细胞总蛋白即可得到单位蛋白含量的相对ALP活性,获得的实验数据进行统计学分析。结果表明:在此浓度范围的成骨细胞特异性识别多肽能促进人颅骨成骨细胞ALP活性的表达（P<0.05）,其有效作用浓度是10-4mol/L。

第三部分:茜素红染色及半定量分析检测人成骨细胞钙化程度体外常规培养人颅骨成骨细胞,用α-MEM培养基将成骨细胞特异性识别多肽配制成五种不同的浓度,分为5个实验组（10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol/L）以及空白对照组,分别于第14、21 d取出细胞,漂洗,固定,茜素红染色,扫描仪扫描照片。每孔加入氯化十六烷基吡啶,待茜素红溶解后,测得吸光度值,获得的实验数据进行统计学分析。结果表明:在此浓度范围的成骨细胞特异性识别多肽能促进成骨细胞的钙盐沉积,半定量分析结果显示在浓度10-5mol/L时,吸光度（OD）值最高,但实验组与对照组之间差异无统计学意义。

参考文献

[1]Effect of Fluoride-Modified Titanium Surface on Early Adhesion of Irradiated Osteoblasts[J].Jun Yuan Li,Li Wu Zheng,Li Ma,Dora Lai Wan Kwong,Lim Kwong Cheung,Edmond Ho Nang Pow,Xiupeng Wang.BioMed Research International.2015

[2]Biology of Bone Tissue:Structure,Function,and Factors That Influence Bone Cells[J].Rinaldo Florencio-Silva,Gisela Rodrigues da Silva Sasso,Estela Sasso-Cerri,Manuel Jesus Sim?es,Paulo Sérgio Cerri,Wanda Lattanzi.BioMed Research International.2015

[3]Novel phage display-derived neuroblastoma-targeting peptides potentiate the effect of drug nanocarriers in preclinical settings[J].Monica Loi,Daniela Di Paolo,Marco Soster,Chiara Brignole,Alice Bartolini,Laura Emionite,Jessica Sun,Pamela Becherini,Flavio Curnis,Andrea Petretto,Monica Sani,Alessandro Gori,Marco Milanese,Claudio Gambini,Renato Longhi,Michele Cilli,Theresa M.Allen,Federico Bussolino,Wadih Arap,Renata Pasqualini,Angelo Corti,Mirco Ponzoni,Serena Marchiò,Fabio Pastorino.Journal of Controlled Release.2013(2)

[4]Biomaterial implants mediate autologous stem cell recruitment in mice[J].A.Nair,J.Shen,P.Lotfi,C.-Y.Ko,C.C.Zhang,L.Tang.Acta Biomaterialia.2011(11)

[5]钱海燕.成骨细胞特异性识别多肽对人成骨细胞增殖和矿化影响的实验研究[D].安徽医科大学,2016.