大鼠尿道上皮细胞的应用

背景^[1-3]

大鼠尿道上皮细胞分离自尿道管组织采用胰蛋白酶-胶原酶混合消化法结合差速贴壁法，并通过上皮细胞专用培养基培养筛选制备而来。

尿道是从膀胱通向体外的管道。尿道上皮细胞主要功能：①尿道上皮细胞排列在膀胱表面，它是由高可塑性和具有多种功能特殊类型的细胞组成；②上皮细胞组成膀胱的防御系统与病原体接触，它们具有多种防御机制来阻止病原体粘着，保持泌尿器溶解物的不渗透性；③膀胱上皮细胞表达雌激素α、β受体，上皮生长因子受体和纤维母细胞生长因子受体，在损伤和感染时，这些受体对膀胱上皮细胞起着重要作用；④能释放许多细胞因子、免疫系统介质。

大鼠尿道上皮细胞

操作方法：

1.取出25cm2培养瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中静置6-8小时或者过夜，以稳定细胞状态。

2.待细胞达到80%汇合时准备进行传代培养。

3.细胞传代

1)吸出25cm2培养瓶中的培养基，用PBS清洗细胞一次；

2)添加0.125%胰蛋白酶消化液约1mL至培养瓶中，37℃温浴3min左右；倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后吸弃消化液，再加入完全培养液终止消化；

3)用吸管轻轻吹打混匀，按1:2或1:3等适当的比例进行接种传代，然后补充新鲜的完全培养基至5mL，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养；

4)待细胞完全贴壁后，培养观察。之后每隔2-3天更换新鲜的完全培养基。

应用^[4][5]

用于邻苯二甲酸二丁酯通过诱导尿路上皮细胞上皮-间充质转化影响大鼠尿道下裂的机制研究

通过研究大鼠怀孕期间暴露于DBP引起后代雄性子鼠发生尿道下裂的模型,检测DBP暴露子鼠生殖结节尿路上皮组织的自噬和EMT指标,并研究DBP处理、AR信号通路、细胞自噬以及EMT间的关联。期望能够揭示孕期DBP暴露引起后代尿道下裂发生的潜在机制。

方法:部分:通过免疫组化分析（IHC）、蛋白免疫印迹（Western blot）和实时荧光定量PCR方法,检测了在DBP暴露引起的尿道下裂组以及食用油暴露的正常对照组子鼠,生殖结节尿路上皮组织自噬相关指标Beclin1和LC3B的表达改变,并用同样方法检测了EMT相关指标表达改变。

第二部分:通过放射性免疫测定法检测了雄性子鼠血清睾酮浓度。通过免疫组化分析、Western blot和实时荧光定量PCR方法检测比较了实验组和对照组间子鼠生殖结节尿路上皮组织AR蛋白表达量的不同。体外通过质粒转染,构建了AR过表达的细胞株SV-HUC-AR。通过Western和实时荧光定量PCR方法检测:DBP处理下外源性表达AR的细胞株SV-HUC-AR和不表达AR的细胞株SV-HUC-V自噬相关标志物的表达。

第三部分:使用Western和实时荧光定量PCR方法,检测自噬诱导剂氯喹CQ或自噬抑制剂雷帕霉素RAPA的添加对DBP促进尿路上皮细胞发生EMT效应的影响。并用同样的方法检测自噬溶酶体抑制剂与蛋白酶抑制剂的添加对DBP诱导的E-cadherin蛋白降解的影响。

参考文献

[1]Adherens junctions:from molecules to morphogenesis.Harris Tony J C,Tepass Ulrich.Nature reviews.Molecular cell biology.2010

[2]Knockdown Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase promotes EMT through downregulation of E-cadherin by mi R-200b inhibition in A549 cells.Y.-H.Wu,Y.-H.Lee,D.T.-Y.Chiu.The FASEB Journal.2016

[3]Epithelial-mesenchymal transition:a special focus on phthalates and bisphenol A.Oral D,Erkekoglu P,Kocer-Gumusel B,et al.Journal of Environmental Pathology and Toxicology.2016

[4]Androgen receptor-mediated apoptosis in bovine testicular induced pluripotent stem cells in response to phthalate esters.S.-W.Wang et al.Cell Death Dis.2013

[5]赵圣.邻苯二甲酸二丁酯通过诱导尿路上皮细胞上皮-间充质转化影响大鼠尿道下裂的机制研究[D].上海交通大学,2018.