蛋白激酶A(抗体)的应用

背景^[1-3]

蛋白激酶A(抗体)是一类可以特异性结合蛋白激酶A的多克隆抗体。主要用于体外检测蛋白激酶A的免疫学实验。

蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）又称依赖于cAMP的蛋白激酶A（cyclic-AMP dependent protein kinase A），是一种结构最简单、生化特性最清楚的蛋白激酶。

PKA全酶分子是由四个亚基组成的四聚体，其中两个是调节亚基（regulatory subunit，简称R亚基），另两个是催化亚基（catalytic subunit，简称C亚基）。R亚基的相对分子质量为49～55kDa，C亚基的相对分子质量为40kDa，总相对分子质量约为180kDa；全酶没有活性。在大多数哺乳类细胞中，至少有两类蛋白激酶A，一类存在于胞质溶胶，另一类结合在质膜、核膜和微管上。

蛋白激酶A

PKA全酶以四聚体形式存在，但PKA被靶向到特定组分时，也会在细胞中形成更高阶的结构。经典的PKA全酶结构由两个调节亚基（R亚基）和两个催化亚基（C亚基）组成。催化亚基包含活性位点、在结合和水解ATP的蛋白激酶中发现的一系列典型残基以及结合调节亚基的结构域。调节亚基具有结合到cAMP的结构域，该结构域与催化亚基和自身抑制结构域相互作用。调节亚基有两种主要形式：RI和RII。

蛋白激酶A是一组结构多样的蛋白质，具有与蛋白激酶A（pka）的调节亚单位结合和将全酶限制在细胞内离散位置的共同功能。AKAP6是AKAP家族的成员。在不同的脑区、心脏和骨骼肌中高度表达。特异性定位于肌浆网和核膜，参与将pka锚定到核膜或肌浆网。

应用^[4][5]

用于蛋白激酶A（PKA）在血小板凋亡中的作用研究

探究蛋白激酶A（protein kinase A,PKA）在血小板凋亡中所发挥的作用。

方法：采集健康志愿者空腹静脉全血,分离得到洗涤血小板及富含血小板血浆（Platelet rich plasma,PRP）,调整血小板的浓度至3×108/ml。人的洗涤血小板与不同浓度的PKA抑制剂H89或对照二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide,DMSO）于22℃孵育160min,利用Western blot检测血小板PKA底物GPIbβ（Ser166）的磷酸化程度,用电子显微镜观察血小板的形态改变。

人的洗涤血小板与H89（37.5μM）或对照DMSO于22℃孵育不同的时间,使用流式细胞仪检测血小板线粒体跨膜电位（Mitochondrial inner transmembrane potential,ΔΨm）变化和磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）外翻程度。

洗涤血小板与不同浓度的PKA激活剂Forskolin或阴性对照（DMSO）在室温下孵育10min,然后用ABT737（1μM）在37℃条件下处理90min,利用流式细胞仪检测血小板ΔΨm和PS外翻的变化。

采集6-8周三种PKA(PKA+/+、PKA+/-、PKA-/-)基因型小鼠下腔静脉全血,分别检测血小板的数量,PKA蛋白的表达情况和PKA底物GPIbβ的磷酸化程度,并且检测血小板ΔΨm去极化程度。

给野生型ICR小鼠注射PKA的抑制剂Rp-c AMPS,之后使用血细胞计数仪检测小鼠体内血小板数量。从糖尿病患者和正常人全血中分别分离血小板和富含血小板血浆（Platelet rich plasma,PRP）,使用Western blot检测血小板中PKA底物GPIbβ的磷酸化程度,用ELISA法检测血小板中PKA的活性,并利用流式细胞仪检测血小板ΔΨm和PS外翻的变化。

利用ELISA法检测糖尿病患者和正常人血浆中凝血酶产生的情况。在体外分别用Forskolin和不同浓度的凝血酶处理血小板,利用流式细胞仪检测血小板ΔΨm和PS外翻的变化。

参考文献

[1]The regulation of Sema4D exodomain shedding by protein kinase A in platelets[J].Chen,Xu,Li,Mou,Zeng,Brass,Zhu.Platelets.2016(7)

[2]Platelet transactivation by monocytes promotes thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia.[J].Tutwiler Valerie,Madeeva Daria,Ahn Hyun Sook,Andrianova Izabella,Hayes Vincent,Zheng X Long,Cines Douglas B,McKenzie Steven E,Poncz Mortimer,Rauova Lubica.Blood.2016(4)

[3]Roflumilast inhibits leukocyte–platelet interactions and prevents the prothrombotic functions of polymorphonuclear leukocytes and monocytes[J].L.Totani,C.Amore,A.Di Santo,G.Dell’Elba,A.Piccoli,N.Martelli,H.Tenor,R.Beume,V.Evangelista.J Thromb Haemost.2016(1)

[4]Thrombin-induced reactive oxygen species generation in platelets:A novel role for protease-activated receptor 4 and GPIbα[J].Naadiya Carrim,Jane F.Arthur,Justin R.Hamilton,Elizabeth E.Gardiner,Robert K.Andrews,Niamh Moran,Michael C.Berndt,Pat Metharom.Redox Biology.2015

[5]李孝东.蛋白激酶A（PKA）在血小板凋亡中的作用[D].苏州大学,2018.