鱼17Α,20Β羟基孕酮(17Α,20ΒOH-PROG)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

鱼17Α,20Β羟基孕酮(17Α,20ΒOH-PROG)ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中17α,20β羟基孕酮(17α,20βOH-PROG)水平。

实验原理：用纯化的17α,20β羟基孕酮(17α,20βOH-PROG)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入17α,20β羟基孕酮(17α,20βOH-PROG)，再与HRP标记的17α,20β羟基孕酮(17α,20βOH-PROG)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的17α,20β羟基孕酮(17α,20βOH-PROG)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中17α,20β羟基孕酮(17α,20βOH-PROG)浓度。

鱼17Α,20Β羟基孕酮(17Α,20ΒOH-PROG)ELISA试剂盒

操作步骤：

1.标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。

4.温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。

5.配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。

6.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

7.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

8.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

9.测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

应用^[4][5]

用于久效磷农药对雄性金鱼（Carassius auratus）性激素合成与转化的影响机制研究

采用0.01mg/L、0.10mg/L和1.00mg/L久效磷农药暴露雄性金鱼21天，首先检测性激素合成底物胆固醇含量变化情况，其次在克隆金鱼多种类固醇生成酶cDNA片段的基础上检测久效磷暴露对其mRNA表达水平的影响，最后检测久效磷暴露条件下性激素合成途径中间产物和效应激素的含量，并分析类固醇生成酶基因表达变化与性激素含量异常的相关关系，以期从性激素合成与转化的角度阐明久效磷农药导致雄性鱼类雄雌激素比例失衡的机制。

研究结果表明：（1）0.01mg/L、0.10mg/L和1.00mg/L久效磷农药暴露雄性金鱼21天，采用全自动生化分析仪测定雄性金鱼血浆中总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯的含量。结果表明：0.10mg/L久效磷农药可使雄鱼血浆中高密度脂蛋白胆固醇含量显著降低，可能会导致运输到精巢组织的性激素合成底物含量降低，从而导致T合成受到抑制。

（2）0.01mg/L、0.10mg/L和1.00mg/L久效磷农药暴露雄性金鱼21天，采用实时定量PCR（real-time PCR）检测精巢中类固醇激素合成急性调节蛋白（steroidogenic acute regulatory protein,StAR）及胆固醇侧链裂解酶（cholesterol sidechain cleavage enzyme,P450scc）、3β-羟类固醇脱氢酶（3β-hydroxysteroiddehydrogenase,3β-HSD）、17α羟化酶（cytochrome P45017alpha-hydroxylase,17,20-lyase,P450c17）等类固醇生成酶mRNA的表达水平，采用酶联免疫分析方法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）测定血浆中孕烯醇酮、孕酮、17α-羟基孕烯醇酮、17α-羟基孕酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮、雌酮、11β-羟基睾酮等性激素合成中间产物的含量。

结果表明：久效磷农药抑制雄性金鱼精巢中StAR mRNA的表达水平，可能会导致转运到线粒体内膜的胆固醇含量减少；久效磷农药抑制P450scc的表达，从而降低血浆中孕烯醇酮的含量；久效磷农药降低3β-HSD、P450c17mRNA的表达水平，导致雄烯二酮含量减少；由此推测久效磷农药对上述类固醇生成途径的抑制作用，是造成雄性鱼类体内雄激素T含量降低的另一机制。

参考文献

[1]Endocrine-related effects of perfluorooctanoic acid（PFOA）in zebrafish,H295R steroidogenesis and receptor reporter gene assays[J].Guizhen Du,Hongyu Huang,Jialei Hu,Yufeng Qin,Di Wu,Ling Song,Yankai Xia,Xinru Wang.Chemosphere.2013

[2]Monocrotophos pesticide modulates the expression of sexual differentiation genes and causes phenotypic feminization in zebrafish（Danio rerio）[J].Xiaona Zhang,Lei Gao,Kunfeng Yang,Hua Tian,Wei Wang,Shaoguo Ru.Comparative Biochemistry and Physiology,Part C.2013(1)

[3]Molecular mechanism（s）of endocrine‐disrupting chemicals and their potent oestrogenicity in diverse cells and tissues that express oestrogen receptors[J].Hye‐Rim Lee,Eui‐Bae Jeung,Myung‐Haing Cho,Tae‐Hee Kim,Peter C.K.Leung,Kyung‐Chul Choi.J.Cell.Mol.Med..2012(1)

[4]Atrazine acts as an endocrine disrupter by inhibiting cAMP-specific phosphodiesterase-4[J].Marek Kucka,Kristina Pogrmic-Majkic,Svetlana Fa,Stanko S.Stojilkovic,Radmila Kovacevic.Toxicology and Applied Pharmacology.2012(1)

[5]王慧.久效磷农药对雄性金鱼（Carassius auratus）性激素合成与转化的影响机制研究[D].中国海洋大学,2013.