植物基因组DNA提取试剂盒的应用

背景^[1-3]

植物基因组DNA提取试剂盒适用于植物叶片、种子的基因组DNA提取，可配合全自动核酸提取仪进行高通量、自动化操作。

植物基因组DNA提取试剂盒

植物基因组DNA提取试剂盒操作步骤：

1取植物新鲜组织约100 mg或干重组织约30 mg，加入液氮充分研磨。2将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μL 65℃预热缓冲液GP1的离心管中（实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1%），迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20 min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。

3加入700μL氯仿，充分混匀，12,000 rpm（~13,400×g）离心5 min。注：若提取富含多酚或淀粉的植物组织，可在第3步前，用酚：氯仿/1:1进行等体积抽提。

4小心的将上一步所得水层上相转入一个新的离心管中，加入700μL缓冲液GP2，充分混匀。

5将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12,000 rpm（~13,400×g）离心30 s，弃掉废液。（吸附柱容积为700μL左右，可分次加入离心。）

6向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm（~13,400×g）离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm（~13,400×g）离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

8重复操作步骤7。

9将吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm（~13,400×g）离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

10将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5 min，12,000 rpm（~13,400×g）离心2 min，将溶液收集到离心管中。

应用^[4][5]

用于玉米基因组DNA提取测定及转植酸酶基因检测方法的研究

以玉米种子为材料,对改良的CTAB法、离心柱法（TIANGEN）、离心柱法（QIAGEN）、磁珠法（Promega）4种基因组DNA提取方法以及紫外分光光度法、Qubit荧光法、Pico Green荧光分光光度法3种DNA浓度测定方法进行评价分析；其次以转植酸酶基因玉米为材料,构建植酸酶基因标准质粒,建立玉米中转植酸酶基因的PCR检测方法；最后设计并筛选出检测玉米中转植酸酶基因的LAMP反应引物,建立玉米中转植酸酶基因的LAMP定量检测方法,构建植酸酶基因LAMP检测标准曲线。

主要研究成果如下：（1）磁珠法（Promega）能有效获得纯度高、完整性好的基因组DNA,并且重复性好,提取得率高,达到813.7 ng/100mg,提取时间短,可在1小时内完成；在基因组DNA浓度测定中,紫外分光光度法、Qubit荧光法、Pico Green荧光分光光度法的相对误差分别为99.8%、49.8%、28.9%,Pico Green荧光分光光度法的准确度最高。

（2）通过基因克隆,获得了合格的植酸酶基因标准质粒；确立了PCR检测的反应体系及反应条件,特异性和灵敏度实验表明PCR引物具有很好的特异性,灵敏度为1000拷贝数,建立了玉米中转植酸酶基因的PCR检测方法。

（3）设计并筛选出1组用于LAMP检测植酸酶基因的引物,确立了LAMP检测的反应体系及反应条件,特异性和灵敏度实验表明PCR引物具有很好的特异性,灵敏度为30拷贝数,建立了玉米中转植酸酶基因的LAMP检测方法；构建了植酸酶基因LAMP检测标准曲线,标准曲线相关系数R2达到0.996,对植酸酶基因的检测限为60拷贝数。

参考文献

[1]Transgenic maize plants expressing a fungal phytase gene[J].Rumei Chen,Guangxing Xue,Ping Chen,Bin Yao,Wenzhu Yang,Qianli Ma,Yunliu Fan,Zuoyu Zhao,Mitchell C.Tarczynski,Jinrui Shi.Transgenic Research.2008(4)

[2]Direct detection of human herpesvirus 6 DNA in serum by the loop-mediated isothermal amplification method[J].Masaru Ihira,Shiho Akimoto,Fumi Miyake,Ayano Fujita,Ken Sugata,Sadao Suga,Masahiro Ohashi,Naoko Nishimura,Takao Ozaki,Yoshizo Asano,Tetsushi Yoshikawa.Journal of Clinical Virology.2007(1)

[3]Development of H5-RT-LAMP（loop-mediated isothermal amplification）system for rapid diagnosis of H5 avian influenza virus infection[J].Masaki Imai,Ai Ninomiya,Harumi Minekawa,Tsugunori Notomi,Toru Ishizaki,Masato Tashiro,Takato Odagiri.Vaccine.2006(44)

[4]Rapid Detection and Quantification of Japanese Encephalitis Virus by Real‐Time Reverse Transcription Loop‐Mediated Isothermal Amplification[J].Hiroko Toriniwa,Tomoyoshi Komiya.Microbiology and Immunology.2006(5)

[5]陈丽丽.玉米基因组DNA提取测定及转植酸酶基因检测方法的研究[D].北京化工大学,2011.