粪便基因组DNA提取试剂盒的应用

背景^[1-3]

粪便基因组DNA提取试剂盒适合于从各种粪便中提取微生物DNA。对粪便中各种细菌、真菌有很好裂解效果，限度的保留了微生物DNA的多态性。

试剂盒提取的DNA产量大、完整性好，可直接用于各种常规操作，包括酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等实验。

粪便基因组DNA提取试剂盒

使用说明

使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

1、称取粪便样本0.1-0.5g，在液氮中充分研磨成细粉末，加入450ul溶液A震荡混匀。也可直接称取样本0.1-0.5g于离心管(建议使用2ml圆底管)，加入450ul溶液A剧烈震荡混匀1-2min至没有固体块。使用液氮研磨效果。

2、加入50ul溶液B充分颠倒混匀(不要剧烈震荡)，65℃水浴6min，每2min充分颠倒混匀一次。

3、加入100ul溶液C充分颠倒混匀(不要剧烈震荡)，12000 rpm离心10min。

4、将上清转移到新的离心管，12000rpm离心2min。

5、在吸附柱中加入200ul溶液D，将离心后的上清加入到带有溶液D的吸附柱中，用移液器吹吸几次混匀，12000 rpm离心1min。

6、将收集管中的滤出液混匀后重新吸入吸附柱(必须)，12000 rpm离心1min。

7、倒掉收集管中的废液，在吸附柱中加入漂洗液500ul，12000 rpm离心1min。

8、倒掉收集管中的废液，重复步骤7两次(共漂洗三次)。

9、倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管，12000 rpm离心2min。

10、拿出吸附柱在室温干燥数分钟(因季节及气候等因素不等)，或50℃干燥1min。

11、将吸附柱放入一个新的离心管中，加入50-100ul洗脱液(65℃预热)，12000 rpm离心1min。

12、将离心管中的液体重新加入到吸附柱中，12000 rpm离心1min。离心管中即为粪便微生物DNA溶液。

应用^[4][5]

用于松辽黑猪肠道内容物及粪便总DNA提取方法对比研究及其盲肠微生物多样性分析研究

总DNA的提取对于肠道微生物群落结构变化、肠道微生物多样性分析等相关研究至关重要。

因此,在利用各种分子生物学技术研究肠道微生物时首先需要一种较为合适的总DNA提取方法。六神曲是由青蒿、辣蓼、苍耳、苦杏仁、赤小豆、麦麸和面粉按一定比例混合经自然发酵而成的曲剂,富含多种酶,如蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶等,具有消食化积、健脾开胃、和中止泻等功能。益生菌具有维持肠道正常微生物菌群、提高免疫力、提高营养物质的消化吸收等功能。

六神曲复合益生菌饲料添加剂具有益生菌、中草药和酶制剂三者共同的特性,作为抗生素替代物开发潜力巨大。

以松辽黑猪为研究对象,利用PCR-DGGE和实时定量PCR技术分析比较了5种提取方法的有效性,并在此基础上解析了六神曲复合益生菌饲料添加剂和抗生素对松辽黑猪仔猪生长性能及其盲肠微生物多样性的影响。

结论:5种方法提取松辽黑猪仔猪盲肠内容物和粪便中总DNA的有效性明显不同采用5中不同的提取方法提取松辽黑猪仔猪盲肠内容物和粪便中总DNA,研究结果显示:QIAamp?DNA Stool Mini Kit提取得到的DNA纯度、得率和所反映的微生物多样性最高,更适合用于松辽黑猪盲肠内容物和粪便中总DNA提取及其微生物多样性分析。

TIANamp Stool DNA Kit和SDS高盐提取法提取得到的DNA纯度、得率和所反映的微生物多样性较低;索莱宝粪便基因组DNA提取试剂盒和TZ裂解液提取法提取得到的DNA纯度和得率最差,微生物多样性最低,不适合用于肠道微生物总DNA提取。

参考文献

[1]The pig gut microbial diversity:Understanding the pig gut microbial ecology through the next generation high throughput sequencing[J].Hyeun Bum Kim,Richard E.Isaacson.Veterinary Microbiology.2015(3-4)

[2]Early‐life establishment of the swine gut microbiome and impact on host phenotypes[J].Núria Mach,Mustapha Berri,Jordi Estellé,Florence Levenez,Ga?tan Lemonnier,Catherine Denis,Jean‐Jacques Leplat,Claire Chevaleyre,Yvon Billon,Jo?l Doré,Claire Rogel‐Gaillard,Patricia Lepage.Environmental Microbiology Reports.2015(3)

[3]Comparison of direct boiling method with commercial kits for extracting fecal microbiome DNA by Illumina sequencing of 16S rRNA tags[J].Xin Peng,Ke-Qiang Yu,Guan-Hua Deng,Yun-Xia Jiang,Yu Wang,Guo-Xia Zhang,Hong-Wei Zhou.Journal of Microbiological Methods.2013(3)

[4]A comparison of the efficiency of five different commercial DNA extraction kits for extraction of DNA from faecal samples[J].Shantelle Claassen,Elloise du Toit,Mamadou Kaba,Clinton Moodley,Heather J.Zar,Mark P.Nicol.Journal of Microbiological Methods.2013(2)

[5]孙盛.松辽黑猪肠道内容物及粪便总DNA提取方法对比研究及其盲肠微生物多样性分析[D].吉林大学,2016.