大鼠胰岛素(INS)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

大鼠胰岛素(INS)ELISA试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）检测样本中胰岛素(INS)的含量。

实验原理：在预包被抗大鼠胰岛素（INS）抗体（固相抗体）的微孔酶标板中，加入大鼠胰岛素（INS）校准品和待测样本，再加入另一株HRP标记的抗大鼠胰岛素（INS）抗体（酶标抗体），经过温育与充分洗涤，去除未结合的组分，在微孔板固相表面形成固相抗体-抗原-酶标抗体的夹心复合物。加底物A和B，底物在HRP催化下，产生蓝色产物，在终止液（2M硫酸）作用下，最终转化为黄色，在酶标仪上测定吸光度（OD值），吸光度（OD值）与待测样品中大鼠胰岛素（INS）的浓度正相关。拟合校准品曲线，可以计算出样本中大鼠胰岛素（INS）的浓度。

大鼠胰岛素(INS)ELISA试剂盒

试剂盒的组分：

（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；

（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；

（3）酶的底物；

（4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参阅标准品和控制血清（定量测定中）；

（5）结合物及标本的稀释液；

（6）洗涤液；

（7）酶反应终止液。

操作步骤：

1.使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2.根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内。

3.加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。

4.甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5.每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

6.甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7.每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。

8.取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9.在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于壬基酚对SD大鼠胰腺结构及胰岛素分泌功能影响的体内外研究

通过对SD雄性大鼠进行亚慢性壬基酚灌胃染毒,结合INS-1（大鼠胰岛β细胞株）细胞体外培养染毒,研究壬基酚对胰腺的毒性作用,探讨造成胰腺损伤的可能机制,为进一步的研究提供相关依据。

方法:32只6周龄清洁级的SD雄性大鼠,适应性喂养一周,随机分为4组:溶剂对照组（0mg/kg）、壬基酚低剂量染毒组（20mg/kg）、壬基酚中剂量染毒组（60mg/kg）和壬基酚高剂量染毒组（180mg/kg）,每组8只大鼠。染毒方式采用每天灌胃染毒,灌胃量维持在1ml左右,连续灌胃90天。

染毒结束后空腹12小时,经腹腔注射麻醉,取腹主动脉血,分离新鲜胰腺组织进行以下实验:

（1）采用免疫组织化学法检测胰岛面积,胰岛α细胞、β细胞的相对容积以及β细胞与α细胞比率;

（2）采用苏木精-伊红（Hematoxylin and Eosin,HE）染色,观察各组大鼠胰腺组织病理学改变;

（3）采用原位末端标记法（TUNEL）检测胰腺组织的细胞凋亡情况;

（4）采用割尾采血法检测大鼠空腹血糖浓度,采用放射免疫法检测腹主动脉血血清中胰岛素与胰高血糖素的含量;

（5）胰腺组织经消化后分离胰岛,采用双硫腙（DTZ）染色,检测单位体积胰腺消化液中胰岛的数量;

（6）采用胰岛素释放试验检测胰岛分泌胰岛素的水平;

（7）以INS-1细胞作为体外实验研究对象,采用CCK-8法检测不同浓度的壬基酚（0、0.025、0.25、2.5、25μmol/L）对INS-1细胞染毒后细胞存活率的影响;

（8）采用胰岛素释放试验检测INS-1细胞经不同浓度的壬基酚处理后的胰岛素分泌功能。

参考文献

[1]ROS-dependent activation of autophagy is a critical mechanism for the induction of anti-glioma effect of sanguinarine[J].Siraj Pallichankandy,Anees Rahman,Faisal Thayyullathil,Sehamuddin Galadari.Free Radical Biology and Medicine.2015

[2]Spatial distribution and migration of nonylphenol in groundwater following long-term wastewater irrigation[J].Shiyu Wang,Wenyong Wu,Fei Liu,Shiyang Yin,Zhe Bao,Honglu Liu.Journal of Contaminant Hydrology.2015

[3]Nonylphenol‐induced apoptotic cell death in mouse TM4 Sertoli cells via the generation of reactive oxygen species and activation of the ERK signaling pathway[J].Mi‐Sun Choi,Han‐Jin Park,Jung‐Hwa Oh,Eun‐Hee Lee,Se‐Myo Park,Seokjoo Yoon.J.Appl.Toxicol..2014(6)

[4]Occurrence and Partitioning of Phenolic Endocrine-Disrupting Chemicals（EDCs）Between Surface Water and Suspended Particulate Matter in the North Tai Lake Basin,Eastern China[J].Yi-zhang Zhang,Wei Meng,Yuan Zhang.Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology.2014(2)

[5]李雪骥.壬基酚对SD大鼠胰腺结构及胰岛素分泌功能影响的体内外研究[D].苏州大学,2017.