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免疫沉淀试剂盒的应用

发布日期:2021/7/27 10:51:08

背景[1-3]

免疫沉淀试剂盒采用蛋白特异结合能力超强的ProteinA、ProteinG为捕获载体,目的蛋白捕获能力高,试验结果重复性和一致性均得到验证,试剂盒提供ProteinA、ProteinG,还可以ProteinA/G混合使用,使免疫(共)沉淀试验变得更加简单、高效。

免疫沉淀图

免疫沉淀IP试剂盒为准备细胞/组织提取物,抗原结合,洗脱步骤提供化的缓冲液.试剂盒中提供的ProteinA/G琼脂糖beads,比起传统的protein A或者protein G树脂,有更广的,更高效价的抗体亚型结合能力.可用于功能性实验,例如蛋白质或者蛋白质复合物的IP/Co-IP。

使用方法

制备细胞裂解物

1.吸干培养基。添加含有调节分子的新鲜培养基,使其在预定的时间内对细胞进行处理。

2.收集细胞,去除培养基后用冰预冷的1 X PBS洗涤细胞一次。

3.去除PBS并在每个细胞板上(10 cm)加入0.5 ml冰预冷的Lysis buffer,并在冰上孵育至少5分钟。

4.从板上刮下细胞,把提取物转移至微量离心管。置于冰上。

5.在冰上进行3次超声破碎,每次5秒。

6.在4°C,在14,000 x g条件下,微量离心10分钟,将上清转移到新管中。上清液即为细胞裂解物。如有必要,裂解物可保存在-80°C。

免疫沉淀法

a)细胞裂解物预清除(可选步骤)

1.向500μl(含总蛋白200-1000 ug)细胞裂解物中添加5μl Protein A和5μl Protein G。

2.在4°C下,旋转孵育30-60分钟。

3.4°C条件下12000g离心1分钟,保留上清,待用。

b)抗原抗体结合

1.在新的离心管内加入500μl(含总蛋白200–1000 ug)细胞裂解物(可以是预清洗后的细胞裂解物)。

2.加入目标蛋白的单克隆/多克隆抗体(1–5μg)。

3.同时采用非特异免疫的同源抗体作为对照。

4.在4°C轻柔混合过夜。

c)免疫复合物沉淀

1.抗体孵育过夜后,加入5μl Protein A和5μl Protein G。

2.在4°C温和地混匀1-3小时或过夜。

3.12,000 g离心1分钟,保留沉淀。

4.使用0.5 ml 1*Wash buffer清洗沉淀,12,000 g离心1分钟,保留沉淀。

5.重复第4步,共计清洗3次。

C.用蛋白免疫印迹法进行分析

1.在20-40μl 1*SDS样品缓冲液中重悬沉淀物,涡旋振荡,然后再微量离心30秒,以使附着管壁的珠子和液体到管底。

2.将样品加热至95-100°C并持续2-5分钟,然后在14,000 g下瞬时离心1分钟,取上清液。

3.将样品(15–30μl)上样到SDS-PAGE凝胶上。

4.用蛋白质印迹法分析样品。

应用[4][5]

用于免疫沉淀筛选与双剪接型2.2Kb HBV剪接变异体特异性蛋白HBDSP相互作用的肝细胞蛋白研究

利用免疫沉淀技术探索能够与双剪接型2.2Kb剪接变异体编码的剪接特异性新蛋白(Hepatitis B Doubly Spliced Protein,HBDSP)相互作用的肝细胞蛋白,以此深入了解其致病性。

运用免疫沉淀(Immunoprecipitation)及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定(MALDI-TOF-MS)的方法获得了四个与HBDSP相互作用的肝细胞蛋白,分别为:通用转录因子II,i(General transcription factor III,GTF2I或TFII-I)、葡萄糖调节蛋白78(Glucose-regulated protein,GRP78)、热休克蛋白70(Heat shock protein70kDa,HSP70)和钾离子通道(Potassiumvoltage-gated channel,KVβ.2)。

通过免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)实验来作验证,结果表明在肝细胞中HBDSP与TFII-I蛋白存在相互作用,而HBDSP与GRP78和KVβ.2没有相互作用。进一步通过GST pull-down实验证实HBDSP与TFII-I蛋白在体外具有相互作用。TFII-I蛋白是一个多功能转录因子,不仅能够促进染色质重塑,同时在细胞有丝分裂周期中具有重要作用。HBDSP与TFII-I的相互作用,可能影响肝癌细胞的分裂和增殖。

参考文献

[1]Direct Interactions of OCA-B and TFII-I Regulate Immunoglobulin Heavy-Chain Gene Transcription by Facilitating Enhancer-Promoter Communication[J].Xiaodi Ren,Rachael Siegel,Unkyu Kim,Robert G.Roeder.Molecular Cell.2011(3)

[2]Phase specific functions of the transcription factor TFII-I during cell cycle[J].Todd Ashworth,Ananda L.Roy.Cell Cycle.2009(4)

[3]The spliced variant of hepatitis B virus protein,HBSP,interacts with Bcl‐2/Bcl‐xl in vitro and induces apoptosis in HepG2 cells[J].Yi WeiLu,Yu DanRen,JingBai,Wei NingChen.IUBMB Life.2008(10)

[4]Glucose-regulated protein GRP78 is up-regulated in prostate cancer and correlates with recurrence and survival[J].Siamak Daneshmand,Marcus L.Quek,Ed Lin,Charlotte Lee,Richard J.Cote,Debra Hawes,Jie Cai,Susan Groshen,Gary Lieskovsky,Donald G.Skinner,Amy S.Lee,Jacek Pinski.Human Pathology.2007(10)

[5]林小玲.免疫沉淀筛选与双剪接型2.2Kb HBV剪接变异体特异性蛋白HBDSP相互作用的肝细胞蛋白[D].福建医科大学,2012.

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