大鼠视网膜微血管内皮细胞的应用

背景^[1-3]

大鼠视网膜微血管内皮细胞采用胶原酶-中性蛋白酶混合消化法结合密度梯度离心法、最后通过内皮细胞专用培养基培养筛选制备而来，细胞经CD31/vWF免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

大鼠视网膜微血管内皮细胞

大鼠视网膜微血管内皮细胞（Rat Retinal Microvascular Endothelial Cells）来源于成年大鼠视网膜组织，其是组成血管腔面单层扁平上皮样细胞，它所产生和分泌的生物活性物质对维持血管张力，调节血压，抗血栓形成等有重要作用，在视网膜血管疾病的发病机制中有重要病理生理学意义。

使用方法：

收到细胞后，请按照以下方法进行操作。

1.取出25cm²培养瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中静置6-8小时或者过夜，以稳定细胞状态。

2.收集瓶内培养基，每瓶细胞仅留8mL左右培养基继续培养，然后根据实验目的进行后续实验。

3.细胞传代

1)吸出25cm²培养瓶中的培养基，用PBS清洗细胞一次；

2)添加0.125%胰蛋白酶消化液约1mL至培养瓶中，37℃温浴3min左右；倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后吸弃消化液，再加入完全培养液终止消化；

3)用吸管轻轻吹打混匀，按1:2或1:3等适当的比例进行接种传代，然后补充新鲜的完全培养基至5mL，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养；

4)待细胞完全贴壁后，培养观察。之后每隔2-3天更换新鲜的完全培养基。

应用^[4][5]

用于苦参碱对体外培养的大鼠视网膜微血管内皮细胞的增殖及VEGF表达的影响研究

研究苦参碱（Matrine,Mat）对体外培养的大鼠视网膜微血管内皮细胞（rat retinal microvascular endothelial cells,RRMECs）的增殖及VEGF表达的影响,明确其可否抑制视网膜微血管内皮细胞的增殖及下调VEGF的表达,为视网膜新生血管的药物防治提供新的思路和理论依据。

方法:原代培养RRMECs,取第三代细胞用于实验。MTT比色法检测不同剂量Mat作用不同时间对RRMECs增殖的抑制作用;台盼蓝染色细胞计数法测定其对RRMECs生长曲线的影响;AO/EB荧光双染色法观察细胞凋亡形态学的改变。

将RRMECs按如下分组处理:（1）阴性对照组:用含20%血清DMEM培养;（2）阳性对照组:含20%血清DMEM+血管抑素130mg/L（3）Mat组:含20%血清DMEM+Mat 40mg/L;（4）高糖组:含20%血清高糖DMEM（葡萄糖浓度25mmol/L）;（5）Mat+高糖组。免疫细胞化学和Western-Blotting检测不同分组处理48小时后细胞VEGF的表达。

结果:MTT比色法测定结果显示:用5、10、20、40、80、160mg/L的Mat处理RRMECs,作用24h细胞增殖抑制率分别为1.42±1.03%、11.50±1.98%、24.98±2.38%、40.27±2.49%、53.54±2.39%、63.88±3.12%;作用48h细胞增殖抑制率分别为4.16±1.14%、14.40±1.78%、33.28±1.83%、53.61±1.32%、63.53±1.96%、73.79±1.12%;作用72h细胞增殖抑制率分别为9.83±2.13%、22.17±4.29%、42.65±1.05%、63.17±1.38%、74.35±2.60%、87.24±4.59%。在5mg/L以上各试验组与对照组相比均具有显著性差异（P<0.05）,各试验组之间两两比较也具有显著性差异（P<0.05）。

随着浓度的增高,作用时间的增加,Mat抑制细胞增殖的作用越明显,当浓度达到40mg/L,作用48小时,细胞抑制率超过了50%。细胞计数绘制生长曲线结果与MTT结果相一致。

参考文献

[1]The Relationship of Retinal VEGF and Retinal IGF-1 mRNA with Neovascularization in an Acidosis-Induced Model of Retinopathy of Prematurity[J].David A.Leske,Jianmin Wu,Martina Mookadam,Yi Chen,Michael P.Fautsch,Jonathan M.Holmes,William L.Lanier.Current Eye Research.2006(2)

[2]VEGF Family Members Regulate Myocardial Tubulogenesis and Coronary Artery Formation in the Embryo[J].Robert J.Tomanek,Yasuo Ishii,Jennifer S.Holifield,Christina L.Sjogren,Heidi K.Hansen,Takashi Mikawa.Circulation Research.2006(7)

[3]Growth Factor Levels and ROP[J].Enrique Villegas Becerril,Rafael Gonzalez Fernández,Francisco Fernández Molina,JoséMaría Gallardo Galera.Ophthalmology.2005(12)

[4]The role of growth factors in the pathogenesis of diabetic retinopathy[J].Grant,Afzal,Spoerri,Pan,Shaw,Mames.Expert Opinion on Investigational Drugs.2004(10)

[5]蒋瑶祁.苦参碱对体外培养的大鼠视网膜微血管内皮细胞的增殖及VEGF表达的影响[D].南华大学,2007.