支原体琼脂培养基的应用

背景^[1-3]

支原体琼脂培养基适用于临床解脲脲原体、支原体分离培养。支原体琼脂培养基主要由含有适合解脲、人型支原体生长的营养琼脂培养基和平皿组成。

支原体琼脂培养基主要组成成份：琼脂粉3%,纯化水70%,尿素0.1%,酪蛋白胨2%,大豆蛋白胨1.5%,精氨酸0.5%,葡萄糖2%。

支原体琼脂培养基

支原体（mycoplasma）是一类没有细胞壁、高度多形性、能通过滤菌器、可用人工培养基培养增殖的最小原核细胞型微生物。由于能形成丝状与分枝形状，故称为支原体。支原体培养是指将支原体接种到培养基中，并观察其生长情况，以判断有无支原体感染。

支原体的营养要求比一般细菌高，除基础营养物质外还需加入10%～20%人或动物血清以提供支原体所需的胆固醇和酵母。支原体的最适pH 7.8～8.0之间，低于7.0则死亡，但解脲支原体最适pH 6.0～6.5。

分离培养是支原体实验室诊断的惟一方法。大多数支原体兼性厌氧，有些菌株在初分离时加入5%CO2生长更好。生长缓慢，在琼脂含量较少的固体培养基上孵育2～3天出现典型的“荷包蛋样”菌落（圆形，直径10～16μm），核心部分较厚，向下长入培养基，周边为一层薄的透明颗粒区。解脲支原体在含尿素和以硫酸锰为产氨指标的完全诊断培养基上生长良好，形成具有特征性的深棕色菌落。

应用^[4][5]

用于牛支原体PCR检测方法的建立及临床应用研究

采集病牛的肺脏、肝、胸腔渗出物等,接种支原体肉汤培养基,同时剪碎病料呈小块状或直接接取胸腔渗出液,在20%马血清琼脂培养基上划线接种,置5%CO2、37℃温箱中培养,5～7d观察判定。

肉汤培养基中生长初期呈轻微浑浊或呈白色点状、丝状生长,以后逐渐均匀浑浊,半透明稍带乳光,不产生菌膜或沉淀,也无颗粒悬浮。

在20%马血清琼脂培养基上生长迟缓,为极小的水滴状圆形略带灰色的微细菌落,中央有乳头状突起。

姬姆萨染色,显微镜观察,菌落为多形态,以球点状最常见,大小在125～250 nm。对病牛肺部实变组织进行DNA模板的提取,并分别以牛支原体、无乳支原体、丝状支原体等为阳性对照,利用支原体通用引物扩增其16SrRNA,建立了扩增16S rRNA序列进行支原体检测的方法,扩增到16S rRNA的基因片段,大小为1.5kb左右,经过测序,并与GenBank公布的支原体16S rRNA基因序列进行比较,分别与几种支原体阳性样本的序列同源性均在97-100%。

支原体的培养困难,生长周期长,营养条件苛刻,使其不能作为早期、快速的检测方法。PCR技术为DNA体外扩增技术,呈2n放大效应,可检测样品中微量级的DNA,具有高灵敏性,因此适于早期检测。

对导致牛支原体病的丝状支原体丝状亚种、牛支原体、无乳支原体和绵羊肺炎支原体设计了4对特异引物,建立了多重PCR方法,以期达到快速检测的目的,试验具有特异性强,敏感性高的特点,为临床检测提供了强有力的技术支持,为临床疑似支原体感染病例的鉴别诊断提供较有效的快速诊断方法。

参考文献

[1]Mastitis in a 7-week old calf caused by Mycoplasma bovigenitalium[J].J.-P.Roy,D.Francoz,O.Labrecque.The Veterinary Journal.2007(3)

[2]The use of real-time PCR in the diagnosis and monitoring of Mycoplasma haemofelis copy number in a naturally infected cat[J].J.A.Braddock,S.Tasker,R.Malik.Journal of Feline Medicine and Surgery.2004(3)

[3]Development and Performance of a Microwell-Plate-Based Polymerase Chain Reaction Assay for Mycoplasma genitalium[J].Susan M.Dutro,Jennifer K.Hebb,Cresley A.Garin,James P.Hughes,George E.Kenny,Patricia A.Totten.Sexually Transmitted Diseases.2003(10)

[4]Surrogate marker for predicting the virus binding of urogenital cancer cells during adenovirus-based gene therapy[J].Yun-Jun Lai,Rey-Chen Pong,John D.McConnell,Jer-Tsong Hsieh.BioTechniques.2003(1)

[5]李彦芹.牛支原体PCR检测方法的建立及临床应用[D].山东农业大学,2009.