人乳腺导管癌细胞T47D的应用

背景^[1-3]

人乳腺导管癌细胞T47D由I Keydar分离自一位54岁乳房侵入性导管癌的女性患者的胸腔积液；分化的上皮亚株(T-47D)有细胞质连接和17β雌二醇及其他类固醇激素、降钙素的受体；表达WNT7B癌基因。培养条件：RPMI 1640(w/o Hepes)10%FBS；0.2 Units/ml牛胰岛素。

人乳腺导管癌细胞T47D

细胞培养步骤

培养基及培养冻存条件准备：

1）准备RPMI-1640培养基；优质胎牛血清，10%；添加0.01mg/ml胰岛素；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

传代方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

应用^[4][5]

用于新型抑癌基因DBC2在非家族性乳腺癌中的缺失表达及其功能研究

研究抑癌基因DBC2在非家族性乳腺癌中的表达状况及其临床意义

1. 病例资料所有病例标本均取乳腺疾病患者,乳腺癌组60例,均为女性首诊可手术的散发性乳腺癌,术前未接受任何治疗。正常乳腺标本30例,取自乳腺良性病变旁正常腺体组织,均经术后病理证实为正常乳腺组织。乳腺癌组发病年龄28～70岁,中位发病年龄46岁。乳腺癌病例术后随访至2009年8月,平均随访48个月,失访4例。

2. 细胞系及组织标本人宫颈癌细胞系HeLa、人卵巢癌细胞系SKOV3、3AO、人膀胱癌细胞系BIU-87、人胃癌细胞系MGC803、人乳腺癌细胞系MCF-7、SKBR3、T-47D、人胚肺成纤维细胞系HELF-6。新鲜胎儿脑组织取自山东大学齐鲁医院妇产科自然流产胎儿。

3. RT-PCR法检测组织标本及细胞系中DBC2 mRNA的表达状况通过RT-PCR法检测8种肿瘤细胞系、正常胚胎组织细胞、60例乳腺癌组织及30例正常乳腺组织中DBC2在mRNA水平的表达状况。

4. 免疫组化法检测组织中DBC2蛋白水平的表达应用免疫组化方法检测60例乳腺癌组织及30例正常乳腺组织中DBC2在蛋白水平的表达状况。

5.统计学方法乳腺癌组和正常乳腺对照组以及不同临床病理类型的肿瘤患者之间DBC2缺失表达率的不同采用Chi-square检验。Kaplan-Meier method用于绘制生存曲线,Log-rank和Gehan-Wilcoxon检验用于分析DBC2表达与肿瘤患者生存时间的关系,Cox比例风险回归用于多因素生存分析。

参考文献

[1]Genetic analysis of the DBC2 gene in gastric cancer[J].Yong Gu Cho,Byung Joon Choi,Chang Jae Kim,Jae Hwi Song,Cao Zhang,Suk Woo Nam,Jung Young Lee,Won Sang Park.Acta Oncologica.2008(3)

[2]DBC2 resistance is achieved by enhancing 26S proteasome-mediated protein degradation[J].Denise Collado,Takashi Yoshihara,Masaaki Hamaguchi.Biochemical and Biophysical Research Communications.2007(3)

[3]Cyclin D1 down-regulation is essential for DBC2’s tumor suppressor function[J].Takashi Yoshihara,Denise Collado,Masaaki Hamaguchi.Biochemical and Biophysical Research Communications.2007(4)

[4]Mutation analysis of the DBC2 gene in sporadic and familial breast cancer[J].M.Ohadi,M.Totonchi,P.Maguire,A.Lindblom,R.Habibi,B.Afshin Alavi,E.Keyhani,H.Najmabadi.Acta Oncologica.2007(6)

[5]毛海婷.新型抑癌基因DBC2在非家族性乳腺癌中的缺失表达及其功能研究[D].山东大学,2010.