部分蛋白酶切多肽谱分析试剂盒的应用

背景^[1-3]

部分蛋白酶切多肽谱分析试剂盒可以对一维蛋白电泳条带进行蛋白酶部分水解所获得的多肽片段进行分析研究，主要用于各种蛋白定性比较、蛋白结构分析及后续质谱分析。

技术原理：将传统蛋白电泳分离获得的特定蛋白条带，切下后，采用特殊的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶再次电泳，经过脱水缓冲液的处理和金黄色葡萄球菌V8蛋白酶的作用，可在分离凝胶上呈现多条鲜明的酶切片段条带，可有效地通过质谱分析获得完整蛋白分钟序列结构。

部分蛋白酶切多肽谱分析试剂盒

金黄色葡萄球菌V8蛋白酶能特异性识别并切割Glu,Asp残基羧基端肽键，V8蛋白酶特异性强还可以保持多肽片段的完整性便于质谱分析。

蛋白质谱技术简单来说就是一种将质谱仪用于研究蛋白质的技术。它的基本原理是蛋白质经过蛋白酶的酶切消化后成肽段混合物，在质谱仪中肽段混合物电离形成带电离子，质谱分析器的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值（即质荷比，M/Z）的肽段离子分离开来，经过检测器收集分离的离子，确定每个离子的M/Z值。经过质量分析器可分析出每个肽段的M/Z，得到蛋白质所有肽段的M/Z图谱，即蛋白质的一级质谱峰图。

离子选择装置自动选取强度较大肽段离子进行二级质谱分析，输出选取肽段的二级质谱峰图，通过和理论上蛋白质经过胰蛋白酶消化后产生的一级质谱峰图和二级质谱峰图进行比对而鉴定蛋白质。

应用^[4][5]

用于胶原检测方法的研究及在食品中的应用研究

以高效液相色谱-质谱为基础,旨在建立一种胶原检测分析方法,采用高效液相色谱-质谱联用技术结合色谱对复杂样品的高分离能力与质谱的高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点,能够在胶原酶解后的大量肽段中分离出不同类型胶原的特征肽并进行定量。

研究成果如下:（1）通过模型蛋白研究了基于特征多肽进行胶原类型识别和定量检测的可行性。以牛I型胶原为模型,通过序列比对进行了特征多肽比对。利用高效液相色谱-离子阱质谱对胶原降解物进行了定性分析,筛选出牛I型胶原特征多肽GFSGLDGAK。结果表明,特征多肽在质谱数据中信号强,二级质谱多肽片段明确,筛选出的多肽可作为相应动物胶原的特征多肽,可用于筛选其他物种或其他类型胶原的特征肽段。实验进一步研究了方法用于猪I、III型胶原以及大鼠I、III胶原类型识别的可行性,筛选出可用于类型识别的特征多肽,包括猪I型胶原特征多肽GETGPAGPAGPVGPVGAR、猪III型胶原特征肽段GPP*GAVGPSGPR、大鼠I型胶原特征肽段GPAGPSGPIGK、大鼠III型胶原特征肽段GPVGPHGPPGK。

（2）样品处理方法筛选与分析条件优化。以牛的I型胶原为实际样品,对前处理条件进行了优化,结果表明,样品与胰蛋白酶比例为50:1时,在37℃下,酶解16h,可达到酶解的效果。在前处理步骤中,样品经过的两次加热处理不会使特征多肽遭到破坏而影响定量的准确性。在质谱分析中,材料选择离子二级质谱分析可提高方法的稳定性和重复性,在优化条件下,信号保持稳定,同一样品连续进样3次,所测峰面积值的相对标准偏差为0.38%-1.45%。

（3）建立了基于特定多肽的胶原定量检测方法。实验经过定性分析筛选出特征肽段,前处理条件的优化分析后,化学合成了特征多肽,GFSGLDGAK。对90个牛I型胶原样品进行定量分析,证明了基于特征多肽进行定量分析的可行性。完成了定量分析的方法学研究,利用该方法对胶原产品的稳定性、均匀性和定值进行分析,确定该产品中牛I型胶原含量为0.926±0.014mg/mg,证明了方法的准确性。

参考文献

[1]Effect of fish gelatine-sodium alginate interactions on foam formation and stability[J].Natthiya Phawaphuthanon,Daeung Yu,Peerapong Ngamnikom,Il-Shik Shin,Donghwa Chung.Food Hydrocolloids.2019

[2]Molecular and tissue alterations of collagens in fibrosis[J].Sylvie Ricard-Blum,Georges Baffet,Nathalie Théret.Matrix Biology.2018

[3]Optimization of collagen extraction from chicken feet by papain hydrolysis and synthesis of chicken feet collagen based biopolymeric fibres[J].Damodar Dhakal,Pisut Koomsap,Anita Lamichhane,Muhammad Bilal Sadiq,Anil Kumar Anal.Food Bioscience.2018

[4]Osteogenesis imperfecta and therapeutics[J].Roy Morello.Matrix Biology.2018

[5]邢芳毓.胶原检测方法的研究及在食品中的应用[D].山东农业大学,2020.