SK-MEL-1 人皮肤黑色素瘤细胞的应用

背景^[1-3]

SK-MEL-1人皮肤黑色素瘤细胞是由Oettgen·F及其同事从一名29岁的患有广泛、快速进展性恶性黑色素瘤的白人男性患者的胸导管中分离建立的。SK-MEL-1细胞可产生黑色素，电镜检测发现SK-MEL-1细胞中色素颗粒与自身合成和吞噬作用相关。在63%的恶性黑色素瘤患者和10%其他疾病患者体内发现了针对SK-MEL-1细胞的抗体。

SK-MEL-1 人皮肤黑色素瘤细胞

培养步骤

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

传代方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

应用^[4][5]

用于microRNA-33a通过靶向HIF-1α抑制黑色素瘤侵袭转移的分子机制研究

通过real-time PCR法检测miR-33a/b在低转移侵袭力的皮肤黑色素瘤细胞株WM35及高转移侵袭力的皮肤黑色素瘤细胞株WM451、A375和SK-MEL-1中的表达量。明确miR-33a/b在黑色素瘤细胞系中的表达情况,筛选miR-33a/b高表达和低表达的黑色素瘤细胞系作为进一步的实验研究对象。

构建pYr-LVX-pri-miR-33a慢病毒载体,并将其包装成慢病毒,然后感染A375细胞,建立hsa-miR-33a稳定过表达细胞系A375-pYr-LVX-pir-miR-33a;构建pYr-LVX-miR-33a-sponge慢病毒载体,并将其包装成慢病毒,然后分别感染WM35、WM451细胞,建立hsa-miR-33a表达抑制的稳定细胞系WM35-pYr-LVX-miR-33a-sponge和、VM451-pYr-LVX-miR-33a-sponge o以1niR-33a表达稳定上调／抑制细胞系为研究对象,运用MTT法检测细胞增殖能力。

平板克隆形成实验检测细胞克隆数；流式细胞术检测细胞凋亡率；细胞划痕实验、Transwell实验检测细胞迁移侵袭力；、Vestern Blot法检测与EMT相关的E-钙粘连蛋白（E-Cadherin）、N-钙粘连蛋白（N-Cadherin）的表达情况。多层面探讨miR-33a的表达对细胞增殖、细胞凋亡、侵袭转移和EMT等表型的影响。

通过皮下接种及尾静脉注射A375及A375-pYr-LVX-pir-miR-33a细胞建立裸鼠种植瘤及移植瘤模型,观察裸鼠皮下种植瘤的大小、体积、质量及肺脏转移灶数目的变化情况。

采用生物信息学分析法预测HIF-1α可能为miR-33a的下游靶因；Western Blot法检测miR-33a表达变化时HIF-1α蛋白的表达水平；应用双荧光素酶基因报告法进一步验证HIF-1α是否为miR-33a的直接靶基因。

研究结果：miR-33a与1niR-33b在低转移侵袭力的人皮肤黑色素瘤细胞株WM35中表达量均高,而在高转移侵袭力的人皮肤黑色素瘤细胞株VM451、A375和SK-MEL-1中的表达量相对较低（WM35>WM451>A375>SK-MEL-1）;上调A375细胞株中1niR-33a的表达能抑制细胞增殖、侵袭转移和上皮-间质转化；抑制WM451和WM35细胞株中miR-33a的表达能促进细胞增殖、侵袭转移和上皮-间质转化；miR-33a对细胞凋亡的影响无统计学差异。

参考文献

[1]MicroRNAs in malignant melanoma[J].Daniel V?ller,Corinna Ott,Anja Bosserhoff.Clinical Biochemistry.2013(10-1)

[2]miR-145 overexpression suppresses the migration and invasion of metastaticmelanoma cells[J].Peter Dynoodt,Reinhart Speeckaert,Olivier De Wever,Inès Chevolet,Lieve Brochez,Jo Lambert,Mireille Van Gele.International Journal of Oncology.2013(4)

[3]Let-7b and microRNA-199a inhibit the proliferation of B16F10 melanomacells[J].Dan Xu,Jianxiang Tan,Ming Zhou,Bimei Jiang,Huiqing Xie,Xinmin Nie,Kun Xia,Jianda Zhou.Oncology Letters.2012(5)

[4]The status of microRNA-21 expression and its clinical significance in human cutaneous malignant melanoma[J].Li Jiang,Xiaoxing Lv,Jing Li,Jinqing Li,Xueyong Li,Wangzhou Li,Yuejun Li.Acta Histochemica.2011(6)

[5]徐丹.microRNA-33a通过靶向HIF-1α抑制黑色素瘤侵袭转移的分子机制研究[D].中南大学,2013.