DCS 小鼠树突状细胞肉瘤的应用

背景^[1-3]

DCS小鼠树突状细胞肉瘤是一类梭形,胞突呈分枝状，常有大小粗细不等的胞突的贴壁细胞。DCS小鼠树突状细胞肉瘤是LⅡ瘤株在615小鼠皮下移植后，取脾脏原代培养，传20代后形成的癌变细胞：细胞呈多角形、梭形及不规则形，胞突呈分枝状，常有大小粗细不等的胞突；经鉴定证明是小鼠树突状肉瘤细胞；在615小鼠皮下移植后成瘤.

DCS小鼠树突状细胞肉瘤

细胞培养步骤：

一．培养基及培养冻存条件准备：

1、准备RPMI-1640培养基(RPMI-1640:GIBCO,货号31800022,添加NaHCO3 1.5g/L,D-葡萄糖2.5g/L,丙酮酸钠0.11g/L)，90%；优质胎牛血清，10%。

2、培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3、冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

二、细胞处理：

1、复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2、细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

应用^[4][5]

用于囊泡膜结合蛋白相关蛋白VAP33对小鼠树突状细胞肉瘤生物学特性的影响研究

采用了具有低转移特性的两个细胞株：小鼠树突状肉瘤细胞DG6和小鼠肺腺癌细胞LA1作为体外模型,通过建立稳定过表达VAP33蛋白的细胞株（DG6-VAP33、LA1-VAP33）来观察细胞的变化。

首先,构建了表达VAP33-GFP融合蛋白的表达载体、建立了DG6-VAP33和LA1-VAP33细胞株。根据Gene Bank中VAP33的mRNA序列设计一对引物,在正反引物的5’端分别加入Pmel和Mlul酶切位点及保护碱基。通过RT-PCR技术从DCS细胞的cDNA中扩增出VAP33,利用基因重组技术,将目的基因克隆到载体pWPXL的Pmel/Mlul酶切位点之间,构建重组载体,经测序该载体构建成功.之后本研究采用慢病毒包装技术,将重组病毒质粒（pWPXL-VAP33）与两种包装质粒（PsPAX2、MD2G）在脂质体Lipofectamine2000介导下共转染293T细胞（人胚肾细胞）,包装出重组慢病毒,分别以不同的MOI值感染目的细胞。

通过荧光显微镜挑选,WB鉴定获得VAP33稳定过表达细胞株（DG6-VAP33和LA1-VAP33）。

接下来又观察VAP33过表达对恶性肿瘤细胞生物学特性的影响。本研究检测了肿瘤细胞在形态、体积、增殖、集落形成、运动和侵袭能力方面的改变,同时设立DG6、LA1细胞为对照组。

细胞分析计数仪CasyTT检测细胞大小,DG6和DG6-VAP33细胞的平均直径分别为16.58μm和15.79μm,细胞大小无明显变化；核浆比分别为1：4.66（DG6）和1:3.99（DG6-VAP33）;

通过显微镜观察,过表达前后的DG6细胞形态也无明显变化；DG6-VAP33和LA1-VAP33集落数分别为（36+5）个/孔和（21±3）个/孔,低于其对照组（52±8）个/孔和（28+4）/孔,P<0.05,说明VAP33抑制肿瘤细胞体外增殖能力；

划痕实验显示VAP33与DG6细胞体外运动能力没有明显关系；transwell方法观察到,DG6-VAP33田胞体外侵袭能力显著下降,穿膜细胞数（28±22）少于DG6（72±34）,P<0.01,而LA1-VAP33体外侵袭能力无明显改变,说明VAP33与肿瘤细胞侵袭能力的关系需更多实验研究确定。

参考文献

[1]Human VAP-C negatively regulates hepatitis C virus propagation.[J].Kukihara Hiroshi,Moriishi Kohji,Taguwa Shuhei,Tani Hideki,Abe Takayuki,Mori Yoshio,Suzuki Tetsuro,Fukuhara Takasuke,Taketomi Akinobu,Maehara Yoshihiko,Matsuura Yoshiharu.Journal of virology.2009(16)

[2]The glycolipid transfer protein interacts with the vesicle-associated membrane protein-associated protein VAP-A[J].Jessica Tuuf,Lina Wistbacka,Peter Mattjus.Biochemical and Biophysical Research Communications.2009(2)

[3]Identifying components of the hair-cell interactome involved in cochlear amplification[J].Zheng Jing,Anderson Charles,Miller Katharine,Cheatham MaryAnn,Dallos Peter.BMC Genomics.2009(1)

[4]Association between polymorphisms in the vesicle-associated membrane protein-associated protein A（VAPA）gene on chromosome 18p and bipolar disorder[J].Falk W.Lohoff,Andrew E.Weller,Paul J.Bloch,Aleksandra H.Nall,Thomas N.Ferraro,Wade H.Berrettini.Journal of Neural Transmission.2008(9)

[5]赵文晶.囊泡膜结合蛋白相关蛋白VAP33对小鼠树突状细胞肉瘤生物学特性的影响[D].北京协和医学院,2012.