小鼠肿瘤组织淋巴、单核巨噬、粒细胞分离液试剂盒的应用

背景^[1-3]

小鼠肿瘤组织淋巴、单核巨噬、粒细胞分离液试剂盒是用于小鼠肿瘤组织淋巴、单核巨噬、粒细胞单个核细胞分离的密度梯度离心液，可用于分离小鼠肿瘤组织淋巴、单核巨噬、粒细胞。

Percoll是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低(<20mosm／kg H２O)，粘度也很小，可形成高达1.3g／mL密度，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200～1000g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于Percoll扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。此外，Percoll不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。

小鼠肿瘤组织淋巴、单核巨噬、粒细胞

实验步骤

1.不同浓度(密度)Percoll溶液的制备:先用9份Percoll与1份8.5％NaCl或1.5M PBS混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液(0.85％NaCl或0.15M PBS)稀释到所需浓度。

2.不连续密度梯度Percoll层的制备:先将试管壁用牛血清湿润，除去多余血清，这种预处理可使逐层叠加的Percoll液平稳沿管壁流下，使形成满意的界面。在制备过程中一般用长针头注射器从高密度向低密度逐层放置，有时相邻两层Percoll比重相差不大时，可将Percoll液放入注射器中，小针头斜面紧贴管壁，任其自然慢慢流下。

3.装样：样品体积和细胞浓度根据不同细胞而异，一般加样体积不宜过大，细胞浓度也不可过高，否则会影响细胞的分离和回收。

4.离心：一般采用离心力为400g，时间20～25min。由于多层Percoll之间密度差别不大，因此离心机加速、降速时要慢，要平稳。

5.取样：当所要分离的细胞绝大部分在两层的界面时，可逐层去除Percoll液后收集界面部位的细胞；有时大部分细胞位于Percoll层中，则需要逐层收集。收获含有Percoll液的细胞经2次洗涤后可供培养或检测用。

应用^[4][5]

用于小鼠肺间质纤维化中巨噬细胞亚型诱导Th17细胞分化及CD147在其中的作用研究

将肺间质纤维化、巨噬细胞亚型、Th17细胞和CD147分子联系起来，阐明肺间质纤维化中M1、M2型巨噬细胞与Th17细胞分化之间的关系及机制，并研究清楚CD147在其中的作用。这将对炎症的研究及治疗起到一定的推动作用。

建立肺间质纤维化小鼠模型，并用HAb18G/CD147抗体治疗，观察小鼠体内巨噬细胞亚型和Th17细胞的数量变化；从肺间质纤维化小鼠的肺组织中分离M1、M2型巨噬细胞和CD4+T细胞共培养，并用HAb18G/CD147抗体封闭和慢病毒干涉CD147，观察Th17细胞的分化情况，阐明肺间质纤维化中M1、M2型巨噬细胞与Th17细胞分化之间的关系及机制，并研究清楚CD147在其中的作用。

方法和结果1HAb18G/CD147抗体治疗肺间质纤维化小鼠及Th17细胞、M1、M2型巨噬细胞数量的变化

1.1肺间质纤维化小鼠模型的建立及HAb18G/CD147抗体治疗9～11周龄的雌性C57BL/6小鼠随机分为3组：模型组（BLM组）24只、HAb18抗体治疗组和治疗对照组，每组各6只。

用气管滴注法建立肺间质纤维化小鼠模型，于造模次日起腹腔注射给药，治疗组用HAb18G/CD147抗体（10mg/kg），治疗对照组予同体积的生理盐水，每日1次。BLM组不予治疗。

1.2检测及研究模型组于注射博来霉素后第4d、7d、14d、28d分批取材，每次每组6只，3只用于肺组织切片，3只用于研磨提取淋巴细胞。

治疗组和治疗对照组于连续给药后第14天取材。将小鼠组织块置4%多聚甲醛/0.1PBS固定24h，经脱水、石蜡包埋后，制作石蜡切片（切片厚度3μm），HE染色观察肺组织炎症改变，Masson染色观察肺组织纤维化情况。

取小鼠肺组织研磨消化后，加入5mL红细胞裂解液，冰上裂解10min，然后轻轻加到5mL小鼠淋巴细胞分离液（购于Mediatech）上层，2000rmp离心20min，吸取中间层的单核、淋巴细胞，用于流式分析。

参考文献

[1]Involvement of HAb18G/CD147 in T cell activation and immunological synapse formation[J].Jinsong Hu,Nana Dang,Hui Yao,Yu Li,Hongxin Zhang,Xiangmin Yang,Jing Xu,Huijie Bian,Jinliang Xing,Ping Zhu,Zhinan Chen.Journal of Cellular and Molecular Medicine.2010(8)

[2]Mechanisms of Foxp3+T Regulatory Cell-Mediated Suppression[J].Ethan M.Shevach.Immunity.2009(5)

[3]Roles of CD147 on T lymphocytes activation and MMP‐9 secretion in Systemic Lupus Erythematosus[J].GinaPistol,CristianaMatache,AnaCalugaru,CrinaStavaru,StefanitaTanaseanu,RuxandraIonescu,SergiuDumitrache,MariaStefanescu.Journal of Cellular and Molecular Medicine.2007(2)

[4]Th17:An Effector CD4 T Cell Lineage with Regulatory T Cell Ties[J].Casey T.Weaver,Laurie E.Harrington,Paul R.Mangan,Maya Gavrieli,Kenneth M.Murphy.Immunity.2006(6)

[5]耿杰杰.小鼠肺间质纤维化中巨噬细胞亚型诱导Th17细胞分化及CD147在其中的作用[D].第四军医大学,2013.