人四氢生物蝶呤(BH4)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人四氢生物蝶呤(BH4)ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中四氢生物蝶呤BH4水平。

实验原理：用纯化的四氢生物蝶呤BH4抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入四氢生物蝶呤BH4，再与HRP标记的四氢生物蝶呤BH4抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的四氢生物蝶呤BH4呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中四氢生物蝶呤BH4浓度。

人四氢生物蝶呤(BH4)

操作步骤:

1.标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。

4.温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。

5.配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。

6.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

7.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

8.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

9.测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。

应用^[4][5]

用于GCH1调控四氢生物蝶呤合成途径对放射性肺损伤进展的影响及机制研究

探讨四氢生物喋呤合成代谢途径在放射性肺损伤中的作用及机制。

方法 体外实验:采用紫外可见光吸收光谱检测BH4在电离辐射受照前后是否发生变化;利用Western Blot技术检测电离辐射受照前后肺细胞内GCH1含量;通过CCK-8实验、克隆形成实验检测GCH1/BH4是否影响辐照肺细胞的增殖情况;采用乳酸脱氢酶细胞毒性实验检测细胞坏死;利用一氧化氮敏感性荧光探针检测过表达GCH1后辐照肺细胞内NO水平;利用活性氧实验检测GCH1/BH4是否影响辐照肺细胞内ROS水平;敲低GCH1后通过免疫荧光实验、荧光素酶实验及Western Blot等实验检测Smad2/3的分布及活性、纤维化相关生物标志物的表达。

体内实验:构建C57小鼠放射性单侧肺损伤模型,照射后立即尾静脉注射Ad-GCH1、对照病毒以及BH4水溶液、对照PBS,一周后检测ROS水平、脂质过氧化水平、NO含量以及TGF-β/Smads和EMT通路相关蛋白含量;三个月后通过HE染色、Masson染色等方法检测C57小鼠肺损伤情况;建立SD大鼠放射性单侧肺损伤模型,尾静脉注射照射Ad-GCH1及BH4水溶液,监测大鼠体重:照射三个月后取肺组织检测大鼠肺损伤相关指标。

参考文献

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[2]Nitric oxide regulates intussusceptive-like angiogenesis in wound repair in chicken embryo and transgenic zebrafish models[J] . Selvaraj Vimalraj,Sivakamasundari Pichu,Thyagarajan Pankajam,Kasiviswanathan Dharanibalan,Valentin Djonov,Suvro Chatterjee.  Nitric Oxide . 2019

[3]Irradiated Human Umbilical Vein Endothelial Cells Undergo Endothelial-Mesenchymal Transition via the Snail/miR-199a-5p Axis to Promote the Differentiation of Fibroblasts into Myofibroblasts[J] . Minxiao Yi,Bo Liu,Yang Tang,Fang Li,Wan Qin,Xianglin Yuan,Paolo Spagnolo.  BioMed Research International . 2018

[4]The Nrf2/GCH1/BH4 Axis Ameliorates Radiation-Induced Skin Injury by Modulating the ROS Cascade[J] . Jiao Xue,Chenxiao Yu,Wenjiong Sheng,Wei Zhu,Judong Luo,Qi Zhang,Hongying Yang,Han Cao,Wenjie Wang,Jundong Zhou,Jinchang Wu,Peng Cao,Ming Chen,Wei-Qun Ding,Jianping Cao,Shuyu Zhang.  Journal of Investigative Dermatology . 2017 (10)

[5]冯阳. GCH1调控四氢生物蝶呤合成途径对放射性肺损伤进展的影响及机制研究[D].苏州大学,2020.