CTLA4 IG-24中国仓鼠卵巢细胞的应用

背景^[1-3]

CTLA4 IG-24中国仓鼠卵巢细胞是一种实验室常见的贴壁细胞系。1957年，Puck TT从成年中国仓鼠卵巢的活检组织建立了CHO细胞；广泛用于生物制品的表达。

CTLA4 IG-24中国仓鼠卵巢细胞

培养步骤：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1、对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4. 按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。弃培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，进行离心收集，1000RPM条件下离心8-10分钟，去除上清，按冻存数量加入血清及DMSO，冻存比例为90%FBS+10%DMSO。

应用^[4][5]

用于CTLA4-Ig重组慢病毒引流淋巴结定向表达的研究

研究CTLA4-Ig直接淋巴结注射后其表达效率、CTLA4-Ig重组慢病毒转染成熟树突状细胞后相关基因的表达，局部注射转染后的成熟树突状细胞后观察CTLA4-Ig在引流淋巴结内的表达，探索淋巴结直接基因治疗方法的可行性；试图通过局部细胞治疗诱导免疫耐受，降低全身免疫抑制剂的用量，为同种异体复合组织移植探索新途径。

方法：1．大鼠淋巴结内注射CTLA4-Ig重组慢病毒，观察CTLA4-Ig在淋巴结内的表达。

2．贴壁培养法体外诱导成熟树突状细胞，进行形态学鉴定、活性及表型鉴定，体外鉴定其免疫学功能。

3．体外试验研究CTLA4-Ig重组慢病毒转染大鼠成熟树突状细胞，观测CTLA4-Ig的表达时间及表达高峰。

4．体内试验研究CTLA4-Ig重组慢病毒转染的成熟树突状细胞于大鼠引流淋巴结的定向表达。

结果：1．实时荧光定量PCR及冰冻切片示，空白对照及阴性对照组淋巴结内均无CTLA4-Ig的表达。CTLA4-Ig重组慢病毒淋巴结内注射组有明显的CTLA4-Ig表达。

2．光镜见培养的成熟树突状细胞集落分散，悬浮，分布较均匀。扫描电镜见细胞表面大量褶皱与粗细不等的突起。流式细胞术显示成熟树突状细胞表面的DC功能相关抗原MHC II、CD80、CD86均高表达。

功能试验检测其分泌IL-12能力较未成熟树突状细胞强，混合淋巴细胞反应显示其有强的刺激T细胞增殖的能力。活细胞率为（80.34±1.25）%。

3．慢病毒转染成熟树突状细胞76h后，于倒置荧光显微镜下可观察到荧光表达。随时间延长，荧光表达增多，细胞形态亦出现老化。转染后第7d细胞明显老化。Q-PCR示CTLA4-Ig重组慢病毒转染成熟树突状细胞第3天，于mRNA水平有CTLA4-Ig的表达，western blotting检测所示结果与Q-PCR一致。

4．距大鼠腋固有淋巴结处2公分皮下缓慢注射所收获的CTLA4-Ig重组慢病毒转染后第3天的DCs，术后第4天取材，Q-PCR显示注射CTLA4-Ig重组慢病毒转染的DCs组于淋巴结内可检测到CTLA4-Ig的表达。

参考文献

[1]Conduits Mediate Transport of Low-Molecular-Weight Antigen to Lymph Node Follicles[J].Ramon Roozendaal,Thorsten R.Mempel,Lisa A.Pitcher,Santiago F.Gonzalez,Admar Verschoor,Reina E.Mebius,Ulrich H.von Andrian,Michael C.Carroll.Immunity.2009(2)

[2]Dendritic cell tolerogenicity:a key mechanism in immunomodulation by vitamin D receptor agonists[J].Luciano Adorini,Giuseppe Penna.Human Immunology.2009(5)

[3]The International Registry on Hand and Composite Tissue Transplantation[J].Palmina Petruzzo,Marco Lanzetta,Jean Michel Dubernard,Raimund Margreiter,Frédéric Schuind,Warren Breidenbach,Roberta Nolli,Stephan Schneeberger,Carlo van Holder,Christina Kaufman,Jerzy Jablecki,Luis Landin,Pedro Cavadas.Transplantation.2008(4)

[4]Bacterial Entry to the Splenic White Pulp Initiates Antigen Presentation to CD8+T Cells[J].Taiki Aoshi,Bernd H.Zinselmeyer,Vjollca Konjufca,Jennifer N.Lynch,Xin Zhang,Yukio Koide,Mark J.Miller.Immunity.2008(3)

[5]曹姣.CTLA4-Ig重组慢病毒引流淋巴结定向表达的研究[D].第四军医大学,2012.