人17Β-雌二醇(17Β-E2)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人17Β-雌二醇(17Β-E2)ELISA试剂盒采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法（ELISA）检测样本中人17Β-雌二醇(17Β-E2)的浓度。

人17Β-雌二醇(17Β-E2)ELISA试剂盒

原理：将标准品、待测样本加入到预先包被人17β-雌二醇（17β-E2）单克隆抗体透明酶标包被板中，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分，再加入酶标工作液，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分。

依次加入底物A、B，底物（TMB）在辣根过氧化物酶（HRP）催化下转化为蓝色产物，在酸的作用下变成黄色，颜色的深浅与样品中人17β-雌二醇（17β-E2）浓度呈正相关，450nm波长下测定OD值，根据标准品和样品的OD值，计算样本中人17β-雌二醇（17β-E2）含量。

检测步骤：

1、用缓冲液将抗体稀释至1-10ug/ml。在反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次。

2、加样：加一定稀释的待检样品0.05ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

3、加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.05ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

4、加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

5、终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml

6、结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果。

应用^[4][5]

用于17β-E2介导GPR30/AMPK/mTOR通路调节MC3T3-E1成骨细胞线粒体自噬的作用机制研究

阐明17β-E2介导GPR30/AMPK/mTOR通路调节MC3T3-E1成骨细胞线粒体自噬的具体作用机制。

方法:体外培养小鼠MC3T3-E1成骨细胞,使用不同浓度的17β-E2处理细胞,并按照分组选择性应用G15（GPR30抑制剂）或Compound C（AMPK抑制剂）。

使用实时定量PCR技术与Western blot方法分别检测MC3T3-E1细胞内GPR30mRNA与蛋白的表达水平;使用免疫荧光检测技术进一步观察GPR30在MC3T3-E1细胞中的表达及定位情况;应用Western blot方法检测线粒体自噬相关蛋白LC3、Tom20、Hsp60以及信号通路蛋白AMPK、mTOR的表达水平;应用透射电子显微镜观察成骨细胞中线粒体自噬小体的形成情况。

结果:1.GPR30在MC3T3-E1细胞中存在内源性表达,17β-E2能提高MC3T3-E1细胞中GPR30的mRNA与蛋白表达水平,当雌二醇浓度为10-7M时促进作用最强。GPR30特异性抑制剂G15可以阻断17β-E2对GPR30蛋白表达的促进作用。

2.17β-E2能提高MC3T3-E1细胞内线粒体自噬相关蛋白LC3、Tom20、Hsp60的表达水平,GPR30特异性抑制剂G15可以阻断17β-E2对线粒体自噬相关蛋白表达的促进作用。

3.透射电子显微镜观察结果显示:17β-E2能促进MC3T3-E1细胞中线粒体自噬小体的生成。4.17β-E2能增加MC3T3-E1细胞中信号通路AMPK蛋白的磷酸化水平,并降低信号通路下游分子mTOR蛋白的磷酸化水平,给予AMPK抑制剂Compound C后,信号通路AMPK蛋白的磷酸化水平降低。

参考文献

[1]Update on the epidemiology,risk factors and disease outcomes of osteoarthritis[J].Terence W.O’Neill,Paul S.McCabe,John McBeth.Best Practice&Research Clinical Rheumatology.2018

[2]Mechanisms,pathophysiological roles and methods for analyzing mitophagy–recent insights[J].Jessica A.Williams,Wen-Xing Ding.Biological Chemistry.2018(2)

[3]Osteoblast role in osteoarthritis pathogenesis[J].Nicola Maruotti,Addolorata Corrado,Francesco P.Cantatore.Journal of Cellular Physiology.2017(11)

[4]Parkin-Independent Mitophagy Controls Chemotherapeutic Response in Cancer Cells[J].Elodie Villa,Emma Pro?cs,Camila Rubio-Pati?o,Sandrine Obba,Barbara Zunino,Jozef P.Bossowski,Romain M.Rozier,Johanna Chiche,Laura Mondragón,Joel S.Riley,Sandrine Marchetti,Els Verhoeyen,Stephen W.G.Tait,Jean-Ehrland Ricci.Cell Reports.2017(12)

[5]刘文博.17β-E2介导GPR30/AMPK/mTOR通路调节MC3T3-E1成骨细胞线粒体自噬的作用机制研究[D].中国医科大学,2020.