大鼠末端补体复合物C5B-9(TCC C5B-9)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

大鼠末端补体复合物C5B-9(TCC C5B-9)ELISA试剂盒是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验检测样本中大鼠末端补体复合物C5B-9(TCC C5B-9的含量。

实验原理：往预先包被大鼠末端补体复合物C5b-9(TCC C5b-9)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的大鼠末端补体复合物C5b-9(TCC C5b-9)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

大鼠末端补体复合物C5B-9(TCC C5B-9)ELISA试剂盒

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于原苏木素A对C5B-9介导下足细胞焦亡保护作用的研究

通过构建C5B-9介导的足细胞焦亡损伤模型,探讨原苏木素A含药血清改善足细胞焦亡损伤的作用机制。

方法:体外建立C5B-9膜攻击复合物使足细胞焦亡的损伤模型,ELLSA法测定C5B-9含量。将不同浓度的原苏木素A含药血清（以下简称原苏木素A）对足细胞进行处理。流式细胞仪实验检测细胞焦亡（PI染色）水平,Western blot方法检测焦亡指标NLRP3、Pro-C aspase-1、active Caspase-1的表达。

结果:1、应用Ellsa试剂盒检测,发现0.8μg/m L的C5B-6致敏足细胞时,C5B-9含量最高。所以后续实验采用此含量构建C5B-9足细胞损伤模型。

2、以不同浓度原苏木素A（0.2ug/ml、0.4ug/ml、0.8ug/ml）含药血清作用于C5B-9介导的足细胞焦亡损伤模型48h后。空白组细胞焦亡最低,模型组细胞焦亡率最高,明显有别于其他组（P<0.05）,表明C5B-9所引起足细胞焦亡损伤,对比模型组而言,应用原苏木素A组过程中,0.2、0.4、0.8μg/ml组的足细胞焦亡损伤率均明显低于模型组（P<0.05）,且伴随药物浓度增加,细胞焦亡率呈现递减趋势,0.8μg/ml组的焦亡率最低。表明足细胞在原苏木素A处理后可有效减轻焦亡损伤。

3、Western blot法检测焦亡指标NLRP3、Pro-Caspase-1、active Caspase-1与空白对照组相比,C5B-9模型组NLRP3、Pro-Caspase-1和active Caspase-1蛋白表达水平明显上调;比较模型组而言,原苏木素A组NLRP3、Pro-Caspase-1和active Caspase-1的蛋白表达水平明显下降,并随药物浓度增加,蛋白下调程度成递减形式。

参考文献

[1]LncRNAs expression in adriamycin-induced rats reveals the potential role of LncRNAs contributing to chronic glomerulonephritis pathogenesis[J].Xiu-juan Qin,Jia-rong Gao,Xian-jin Xu,Hui Jiang,Liang-bing Wei,Nan-nan Jiang.Gene.2018

[2]Potential role of lncRNAs in contributing to pathogenesis of chronic glomerulonephritis based on microarray data[J].Jia-rong Gao,Xiu-juan Qin,Hui Jiang,Ya-chen Gao,Ming-fei Guo,Nan-nan Jiang.Gene.2018

[3]Long non-coding RNAs:Mechanism of action and functional utility[J].Shakil Ahmad Bhat,Syed Mudasir Ahmad,Peerzada Tajamul Mumtaz,Abrar Ahad Malik,Mashooq Ahmad Dar,Uneeb Urwat,Riaz Ahmad Shah,Nazir Ahmad Ganai.Non-coding RNA Research.2016(1)

[4]Super-resolution stimulated emission depletion imaging of slit diaphragm proteins in optically cleared kidney tissue[J].David Unnersj-Jess,Lena Scott,Hans Blom,Hjalmar Brismar.Kidney International.2016(1)

[5]龚一萌.原苏木素A对C5B-9介导下足细胞焦亡保护作用的研究[D].黑龙江省中医药科学院,2020.