单细胞全基因组扩增试剂盒的应用

背景^[1-3]

单细胞全基因组扩增试剂盒基于多重链置换扩增的Phi29 DNA聚合酶等温扩增体系，Phi29 DNA聚合酶是从Bacillus subtilis噬菌体Phi29中克隆出的嗜温DNA聚合酶，利用基因重组技术，在大肠杆菌中进行表达后经多次纯化分离而得。Phi29 DNA聚合酶具有很强的链置换活性，可实现对DNA复杂结构的解链与复制。同时具有高效的DNA合成能力，可连续合成多达70kb的DNA片段。Phi29 DNA聚合酶具有很强的3’→5’外切酶活性，保真度高于绝大多数高保真酶，因此Phi29 DNA聚合酶特别适合用于全基因组扩增。

单细胞全基因组扩增

本试剂盒可以实现单个细胞或者少量样本的全基因组无差别扩增，一个反应可以达到40ug的全基因组DNA。低质量样品会影响DNA的最终产量，如果以DNA样品为模板，需避免使用降解的DNA作为起始模板。

操作步骤：

适用于以1-1000个新鲜配制的细胞样品作为模板，以保证起始基因组的完整性。

1、将细胞用PBS洗涤三次。

2、取一倍体积的细胞，加入一倍体积的Cell Lysis Buffer，轻轻混匀（勿涡旋混匀）后置于冰上放置10min。

3、加入一倍体积的Neutralization Buffer，轻轻混匀，勿涡旋混匀。

4、从上述混合液中取3μL样品，加入7μL无菌水，10μL Reaction Buffer。将20uL上述处理后的样品加入到25uL GenoPhi29 Buffer中。

注意：如果不进行后续反应，需冰上放置。

5、加入5μL GenoPhi29 Enzyme，30℃反应3h。

注意：65℃，10min失活Phi29 DNA聚合酶。

6、扩增产物是高浓度基因组DNA，需要将扩增产物用无菌水或者TE缓冲液进行稀释后进行下游实验。

应用^[4][5]

用于基于单细胞全基因组扩增的同时检测基因点突变与染色体拷贝数变异的高通量测序方法的建立与评估

通过活检废弃卵裂球胚胎结合分离外周血单个白细胞,进行单细胞全基因组扩增。研究高通量测序文库构建方法对DNA高通量测序测序覆盖度、敏感性、特异性等的影响;研究不同测序深度及获取数据量对DNA高通量测序测序覆盖度、敏感性、特异性等的影响;建立基于单细胞全基因组扩增的基因点突变及染色体拷贝数变异的高通量测序方法,优化单细胞全基因组扩增产物高通量测序流程。

方法:在体视镜下分离已知致病突变位点的β地中海贫血患者外周血单个白细胞、活检废弃卵裂球胚胎。随后进行单细胞全基因组扩增,以单细胞全基因组扩增产物作为模板,对HBB基因目标区域进行PCR扩增。

采用两种方法构建高通量测序文库:（1）单细胞全基因组扩增产物及PCR产物按1:99;3:97;5:95及10:90的比例混合后,再构建高通量测序文库;

（2）单细胞全基因组扩增产物及PCR产物分别构建高通量测序文库,两种测序文库按1:99;3:97;5:95及10:90的比例混合。0.1×、2×测序深度下进行高通量测序。通过比较各检测方案的目标致病突变检测效率、染色体覆盖深度与覆盖率、染色体拷贝数变异检测的均一性,建立并优化基于单细胞全基因组扩增的同时检测基因点突变与染色体拷贝数变异的高通量测序方法。

用5例已知致病突变位点的β地中海贫血患者外周血单个白细胞和5例废弃卵裂球胚胎对所建立的方法进行扩大验证。

结果:所有检测方案对目标致病突变检测的灵敏度和特异性均为100%。

参考文献

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[2]Live births after simultaneous avoidance of monogenic diseases and chromosome abnormality by next-generation sequencing with linkage analyses.[J].Yan Liying,Huang Lei,Xu Liya,Huang Jin,Ma Fei,Zhu Xiaohui,Tang Yaqiong,Liu Mingshan,Lian Ying,Liu Ping,Li Rong,Lu Sijia,Tang Fuchou,Qiao Jie,Xie X Sunney.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.2015(52)

[3]Successful implantation and live birth of a healthy boy after triple biopsy and double vitrification of oocyte-embryo-blastocyst[J].Ermanno Greco,Anil Biricik,Rocio P Cotarelo,Elisabetta Iammarone,Patrizia Rubino,Jan Tesarik,Francesco Fiorentino,Maria Giulia Minasi.SpringerPlus.2015(1)

[4]Validation of a semiconductor next‐generation sequencing‐based protocol for preimplantation genetic diagnosis of reciprocal translocations[J].S.Bono,A.Biricik,L.Spizzichino,A.Nuccitelli,M.G.Minasi,E.Greco,F.Spinella,F.Fiorentino.Prenat Diagn.2015(10)

[5]邱碧原.基于单细胞全基因组扩增的同时检测基因点突变与染色体拷贝数变异的高通量测序方法的建立与评估[D].成都中医药大学,2018.