线粒体提取试剂盒的应用

背景^[1-3]

线粒体提取试剂盒用于从动物细胞或组织中分离出完整而纯化的线粒体。适合于动物软组织（肝或脑组织）和硬组织（肌肉）以及培养细胞的线粒体的制备。其制备物产量高，可以被用于细胞凋亡、信号传递、代谢和蛋白组学等的研究。

线粒体提取原理图

原理：细胞/组织通过Buffer A致敏，然后细胞以Z字形路径通过离心管柱，在这个过程中细胞膜会破裂。进而通过差速离心和密度离心分离出完整的线粒体，整个过程无需匀浆和超高速离心。

操作步骤：

1.样本处理a.组织匀浆：称取100~200 mg新鲜组织如肝脏、脑、心肌等，PBS或生理盐水冲洗，洗净血水，滤纸吸干，用剪刀剪为碎块放入小容量玻璃匀浆器内。加入1.0 mL冰预冷的Lysis Buffer，0℃冰浴上下研磨组织20次；b.培养细胞匀浆：消化细胞，PBS洗涤，800g离心5~10 min收集细胞，计数。每次提取需要5×107个细胞，加入1.0 mL冰预冷的Lysis Buffer重悬细胞，将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内，0℃冰浴研磨30~40次。

2.将组织或细胞匀浆物转移到离心管，4℃，1000g离心5 min。

3.取上清，转移至新的离心管中，4℃，1000g再次离心5 min。

4.取上清，转移至新的离心管中，4℃，12,000 g离心10 min。离心后的上清含胞浆成分，可从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管，线粒体沉淀在管底。

5.往线粒体沉淀中加入0.5 mL Wash Buffer重悬线粒体沉淀，4℃，1000 g离心5 min。

6.取上清，转移至新的离心管中，4℃，12,000 g离心10 min。弃上清，高纯度的线粒体沉淀在管底。

7.用50-100μL Store Buffer或合适的反应缓冲液重悬线粒体沉淀，立即使用或-70℃保存。

应用^[4][5]

用于人参皂苷Re对慢性缺血致血管痴呆大鼠的线粒体保护作用研究

探讨人参皂苷Re对慢性缺血性血管痴呆（VD）大鼠海马神经元缺血损伤和线粒体功能障碍的保护作用,为开发安全有效的防治VD药物提供实验依据。

方法:应用分次离断结扎双侧颈总动脉法建立VD大鼠模型;利用Morris水迷宫和HE染色判定模型构建效果;采用试剂盒提取各组线粒体及蛋白质,并通过电镜技术、Western-blot实验和H2O2试剂盒比较各组差异。

利用真空泵和CO2孵箱建立缺氧复氧模型,采用LDH释放量检测、DNA琼脂糖电泳及细胞形态观察验证模型建立效果。进一步通过检测各组LDH释放量、DNA断裂程度及细胞状态,并通过提取线粒体和蛋白质和应用Western Blot和H2O2试剂盒研究人参皂苷Re的作用。

结果:分次离断结扎大鼠双侧颈总动脉后,大鼠认知能力下降,逃避潜伏期明显延长。细胞形态结构显示,大鼠海马神经元排列紊乱,细胞周围呈空泡化,失去正常结构。

COX IV、PDH-A1和H2O2的表达结果显示,不同浓度的人参皂苷Re对大鼠VD线粒体的COX IV和PDH-A1的表达均有明显促进作用,而对H2O2释放量有一定抑制作用,表明人参皂苷Re可修复海马神经元的线粒体损伤。

大鼠海马神经元经缺氧复氧后,其模型组LDH释放量增高、DNA断裂加剧、神经元突起退化及胞体固缩;而人参皂苷Re可有效抑制LDH释放、DNA断裂及突触退化,促进对线粒体COX IV和PDH-A1的表达,抑制H2O2的释放。

参考文献

[1]Effects of eldepryl on glial cell proliferation and activation in the substantia nigra and striatum in a rat model of Parkinson’s disease[J].Bin Liu,Chaonan Lv,Jinxia Zhang,Ying Liu,Jing Sun,Xiaohua Cheng,Wenjing Mao,Yuanyuan Ma,Shiying Li.Neurological Research.2017(5)

[2]Alzheimer’s disease as an inflammatory disease[J].Marta Bolós,Juan Ramón Perea,Jesús Avila.Biomolecular Concepts.2017(1)

[3]Novel insights into role of miR‐320a‐VDAC1 axis in astrocyte‐mediated neuronal damage in neuroAIDS[J].Mahar Fatima,Bharat Prajapati,Kanza Saleem,Rina Kumari,Chitra Mohindar Singh Singal,Pankaj Seth.Glia.2017(2)

[4]Kinetic activity,membrane mitochondrial potential,lipid peroxidation,intracellular pH and calcium of frozen/thawed bovine spermatozoa treated with metabolic enhancers[J].R.Boni,A.Gallo,S.Cecchini.Andrology.2017(1)

[5]李兆东.人参皂苷Re对慢性缺血致血管痴呆大鼠的线粒体保护作用[D].吉林大学,2017.