植物苯丙氨酸解氨酶ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

植物苯丙氨酸解氨酶ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定样品指标水平。样品包括血清血浆尿液脑脊液细胞固体组织等，用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入样品，再与HRP标记的抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品浓度呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中浓度，或者与CUTOFF值相比较，从而判定标本阴阳性。

植物苯丙氨酸解氨酶ELISA试剂盒

操作步骤：

1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照随货说明书中图表在小试管中进行稀释。

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用

5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟.

10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11.测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

应用^[4][5]

用于茶树两个响应低温与干旱胁迫的苯丙氨酸解氨酶基因克隆、表达与功能分析

于茶树基因组研究结果,克隆获得了南川大树茶苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanineammonialyase,PAL）家族基因成员CsPAL-a和CsPAL-d的cDNA和启动子序列,推导了其编码的氨基酸序列,并对其进行了生物信息学分析。对南川大树茶两年生植株进行4℃低温和PEG6000模拟干旱处理,通过测定遭受胁迫后的茶树叶片内可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、丙二醛含量、相对电导率和抗氧化酶活性,分析了以上两种胁迫对南川大树茶和CsPAL-a、CsPAL-d的表达模式的影响。

利用实时荧光定量和组织化学染色法分析了CsPAL-a和CsPAL-d的组织特异性表达。借助在模式植物拟南芥中过表达验证了CsPAL-a和CsPAL-d的功能。

主要结果如下:1、茶树CsPAL-a和CsPAL-d基因的克隆和序列分析从南川大树茶中克隆获得两个PAL基因,分别为CsPAL-a和CsPAL-d。其中CsPAL-a的ORF框长2121 bp,编码706个氨基酸残基,推测分子量77.08 kD,等电点6.26。CsPAL-d的ORF框长2145 bp,编码714个氨基酸残基,推测分子量77.73 kD,等电点6.12。序列分析显示CsPAL-a和CsPAL-d均为亲水性蛋白,不含有跨膜结构域,均具有苯丙氨酸解氨酶的保守结构域,在系统进化关系上与葡萄的亲缘关系较近。

2、CsPAL-a和CsPAL-d响应低温和干旱胁迫qPCR检测结果表明,在正常生长条件下,南川大树茶叶片中CsPAL-a的表达量约为CsPAL-d的7倍,当人为对南川大树茶进行低温和干旱处理后,发现CsPAL-a和CsPAL-d的表达水平均显著提高,CsPAL-a表达上调约3倍,CsPAL-d表达上调高达10倍。这表明CsPAL-a和CsPAL-d在南川大树茶抵抗低温和干旱胁迫方面发挥着积极作用。

参考文献

[1]Identification of novel cis‐elements bound by BplMYB46 involved in abiotic stress responses and secondary wall deposition[J].Huiyan Guo,Liuqiang Wang,Chuanping Yang,Yiming Zhang,Chunrui Zhang,Chao Wang.Journal of Integrative Plant Biology.2018(10)

[2]Transcriptome sequencing dissection of the mechanisms underlying differential cold sensitivity in young and mature leaves of the tea plant（Camellia sinensis）[J].Na-na Li,Chuan Yue,Hong-li Cao,Wen-jun Qian,Xin-yuan Hao,Yu-chun Wang,Lu Wang,Chang-qing Ding,Xin-chao Wang,Ya-jun Yang.Journal of Plant Physiology.2018

[3]A comparison of the molecular mechanisms underpinning high-intensity,pulsed polychromatic light and low-intensity UV-C hormesis in tomato fruit[J].G.Scott,M.Dickinson,G.Shama,M.Rupar.Postharvest Biology and Technology.2018

[4]Six phenylalanine ammonia-lyases from Camellia sinensis:Evolution,expression,and kinetics[J].Yingling Wu,Wenzhao Wang,Yanzhi Li,Xinlong Dai,Guoliang Ma,Dawei Xing,Mengqing Zhu,Liping Gao,Tao Xia.Plant Physiology and Biochemistry.2017

[5]仪丹.茶树两个响应低温与干旱胁迫的苯丙氨酸解氨酶基因克隆、表达与功能分析[D].西南大学,2020.