PCR优化试剂盒的应用

背景^[1-3]

PCR优化试剂盒提供8种耐热聚合酶和相应的精心配制的缓冲液，其中缓冲液的pH值，盐离子浓度和助溶剂成分等各不相同，当扩增某些复杂的基因模板等出现问题时，应测试不同的聚合酶及反应缓冲体系。

另外，PCR优化试剂盒还提供了PCR增强剂，能增加引物的特异性，提高DNA聚合酶的热稳定性，适应较宽范围的退火温度和Mg2+浓度。可以在试剂盒提供的8种聚合酶及相应反应体系的基础上再添加PCR增强剂，以找到PCR最适反应体系从而达到的PCR反应效果。

PCR优化胶图

聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的特点是能将微量的DNA大幅增加。

PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

标准的PCR过程分为三步：

DNA变性：（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA

退火：（60℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链。

每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。如图所示：现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。

应用^[4][5]

用于食品中单增李斯特菌的分离鉴定及PCR快速检测方法的研究

基于单增李斯特菌MyA基因和李斯特菌属的16sRNA基因分别合成两对引物,对影响PCR的主要因素进行优化,建立可同时检测两个特异基因的PCR方法,即双重PCR方法及荧光PCR方法。

将两种PCR检测方法分别与选择增菌法结合,应用在食品样品的检测中。此双重PCR方法特异性良好,对纯菌液的检测灵敏度为3.2×102CFU/mL,模拟污染的海螺检测限为4CFU/g。应用该双重PCR方法对市场随机抽取的126份新鲜海螺样品进行检测,检测结果经GB 4789.30-2010验证。

验证结果表明,出现双条带的海螺样品为阳性样品,无条带出现或仅出现单一条带的海螺样品为阴性样品。126份海螺样品中共检出阳性样品16份,检出率为12.7%。

此荧光PCR方法的反应液经凝胶电泳验证,结果显示,扩增出的两条不同大小、不同Tm值的目的核酸片段,分别对应两条荧光PCR溶解曲线上的两个独立波峰。基于单增李斯特菌hlyA基因建立标准曲线,相关系数为0.996,最低检出限约为89CFU/mL。

参考文献

[1]Development and validation of qualitative SYBR?Green Real-Time PCR for detection and discrimination of Listeria spp.and Listeria monocytogenes[J].Elodie Barbau-Piednoir,Nadine Botteldoorn,Marc Yde,Jacques Mahillon,Nancy H.Roosens.Applied Microbiology and Biotechnology.2013(9)

[2]Simultaneous detection of pathogenic B.cereus,S.aureus and L.monocytogenes by multiplex PCR[J].T.D.Kalyan Kumar,H.S.Murali,H.V.Batra.Indian Journal of Microbiology.2009(3)

[3]Evaluation of a multiplex PCR assay as an alternative method for Listeria monocytogenes serotyping[J].Journal of Microbiological Methods.2009(2)

[4]Subversion of cellular functions by Listeria monocytogenes[J].JavierPizarro‐Cerdá,PascaleCossart.J.Pathol..2005(2)

[5]王昊宇.食品中单增李斯特菌的分离鉴定及PCR快速检测方法的研究[D].大连工业大学,2013.