人细胞色素C(CYT-C)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人细胞色素C(CYT-C)ELISA KIT采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)，往预先包被抗原的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗原，经过温育并彻底洗涤等一系列操作流程，检测出待测样本的含量。

人细胞色素C(CYT-C)

人细胞色素C(Cyt-C)ELISA kit明书操作步骤：

1、加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品*终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

2、温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

3、配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用

4、洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此

重复5次，拍干。

5、加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

6、显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色

10分钟.

7、终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

8、测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

应用^[4][5]

用于大黄素对人肝癌细胞株SMMC-7721凋亡及Cyt C、Smac表达的影响研究

观察大黄素在体外对肝癌细胞凋亡及线粒体细胞色素C（Cytochrome C,Cyt C）、线粒体促凋亡蛋白Smac/DIABLO（Smac）表达水平的影响,进一步探讨其诱导肿瘤细胞凋亡的机制。

方法：人肝癌SMMC-7721细胞株培养后,随机分为5组,分别用0、20、40、80μmol·L-1大黄素进行干预,同时设置100μmol·L-15-氟尿嘧啶（5-Fu）阳性对照组,药物作用时间均为48小时。运用流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡,荧光定量PCR（Real time quantitative polymerase chain reaction,Real time PCR）检测各组Cyt C及Smac mRNA的表达,蛋白印迹技术（Western blot）分别检测各组细胞胞浆内Cyt C和Smac蛋白的表达情况。

结果：流式细胞仪检测结果显示：与空白对照组比较,大黄素干预后的肝癌细胞早期凋亡率明显增高,活细胞率明显减少（P<0.01）,随着大黄素浓度的增加,细胞早期凋亡率呈递增趋势,活细胞率呈递减趋势；

Real time PCR检测结果显示大黄素处理后的肝癌细胞Cyt C和Smac mRNA表达与空白对照组比较明显增强（P<0.05）;

Western blot检测结果显示大黄素干预组胞浆内Cyt C和Smac蛋白表达均高于空白对照组（P<0.01）,并且随着大黄素浓度的增高,Cyt C、Smac mRNA和胞浆内Cyt C、Smac蛋白的表达均逐渐增强。

结论：大黄素既可促进肝癌细胞Cyt C和Smac的转录合成,又可促进Cyt C和Smac从线粒体膜间隙向细胞质内的释放,通过线粒体Caspase依赖凋亡通路诱导肝癌细胞凋亡,从而发挥其抗肿瘤作用。

参考文献

[1]Emodin-Induced Generation of Reactive Oxygen Species Inhibits RhoA Activation to Sensitize Gastric Carcinoma Cells to Anoikis[J].Jun Cai,Xin Niu,Yuying Chen,Qingshen Hu,Guiying Shi,Huacheng Wu,Jian Wang,Jing Yi.Neoplasia.2008(1)

[2]Emodin induces apoptosis through caspase 3-dependent pathway in HK-2 cells[J].Cuifen Wang,Xudong Wu,Min Chen,Weigang Duan,Lixin Sun,Ming Yan,Luyong Zhang.Toxicology.2007(2)

[3]Anthraquinone derivative emodin inhibits tumor-associated angiogenesis through inhibition of extracellular signal-regulated kinase 1/2 phosphorylation[J].Tatsuya Kaneshiro,Takamitsu Morioka,Morihiko Inamine,Tatsuya Kinjo,Junya Arakaki,Itaru Chiba,Nao Sunagawa,Masumi Suzui,Naoki Yoshimi.European Journal of Pharmacology.2006(1)

[4]Therapeutic targeting of the tumor microenvironment[J].Johanna A.Joyce.Cancer Cell.2005(6)

[5]杨阿莉.大黄素对人肝癌细胞株SMMC-7721凋亡及Cyt C、Smac表达的影响[D].中南大学,2010.