泛素硫酯酶L3抗体的应用

背景^[1-3]

泛素硫酯酶L3抗体是一类可以特异性结合泛素硫酯酶L3蛋白的多克隆抗体，主要用于检测泛素硫酯酶L3的免疫学实验。

泛素羧基末端水解酶L3(ubiquitin C-terminal hydrolase-L3,UCHL3)是真核细胞泛素羧基末端水解酶家族(ubiquitin C-terminal hydrolases,UCHs)的重要成员,参与了DNA损伤修复等过程.近期研究表明,UCHL3不仅在体外条件下可以切割C端用香豆素修饰的泛素分子(C-terminal conjugate of ubiquitin with 7-amino-4-methylcoumarin,Ub-AMC),当UCHL3上第75位的丝氨酸(Ser75)发生磷酸化后,其在细胞内切割多聚泛素链的活性也明显增强。

泛素硫酯酶L3

泛素蛋白水解酶参与泛素前体和泛素化蛋白的加工。该酶是一种硫醇蛋白酶，可识别并水解遍在蛋白C端甘氨酸上的肽键。还与游离的单泛素结合，并可以防止其在溶酶体中降解。同型二聚体可以具有不依赖ATP的泛素连接酶活性。

两种泛素C末端水解酶（UCH）酶UCHL1和UCHL3使泛素蛋白偶联物脱泛素化，并控制泛素的细胞平衡。UCHL1和UCHL3都是约220个氨基酸的小蛋白，具有40％以上的氨基酸序列同一性。

UCHL3在所有组织中普遍表达，而UCHL1仅在神经元组织，睾丸和卵巢中表达。当使用荧光泛素底物时，UCHL3的活性比UCHL1高200倍以上。UCHL1与单泛素结合，UCHL3与Nedd8（泛素样蛋白）结合。UCHL1和UCHL3在调节神经元发育和精子发生中起作用。UCHL1参与帕金森氏病（PD）和阿尔茨海默氏病（AD）的发病机理。

应用^[4][5]

用于K27链接二泛素及其识别蛋白UCHL3的结构生物学研究

围绕UCHL3识别K27泛素链,并参与DNA损伤修复调控,展开了UCHL3识别K27泛素链的分子机制研究。

结果:1.利用ITC方法体外验证了UCHL3对K27 diub的特异性识别作用。

2. 通过解析UCHL3与K27二泛素复合物的晶体结构,首次发现UCHL3具有S1和S2两个泛素识别位点。S1位点识别近端泛素分子C末端。S2位点与远端泛素分子上经典的I44产生疏水相互作用,并辅以His153及Glu158为中心形成氢键网络。对UCHL3进行关键氨基酸点突变后,与K27 diub之间的相互作用力明显降低。

3. 通过结构比对,发现与UCHL3结合后K27 diub的构象更加伸展,呈现相对开放的状态。

4. 序列对比和系统发育树显示,磷酸化位点(Ser75)仅仅存在于UCHL3中,在其它UCH家族蛋白中中并不存在,暗示UCHL3的磷酸化调控在UCH家族中具有特异性。

5. 发现磷酸化位点(Ser75)在不同种属UCHL3中广泛存在,暗示UCHL3的磷酸化调控机制在进化上保守。值得注意的是,在模式生物拟南芥中磷酸化位点Ser突变为Glu,暗示UCHL3蛋白在拟南芥中可能是组成性活化的形式,无需其它激酶的磷酸化修饰便可切割泛素链。

6.模拟磷酸化的UCHL3提高了对Ub-AMC的切割活性,但依旧无法对二泛素进行生理水平上的活性切割。

参考文献

[1]UCHL3 Regulates Topoisomerase-Induced Chromosomal Break Repair by Controlling TDP1 Proteostasis[J].Chunyan Liao,Ryan Beveridge,Jessica J.R.Hudson,Jacob D.Parker,Shih-Chieh Chiang,Swagat Ray,Mohamed E.Ashour,Ian Sudbery,Mark J.Dickman,Sherif F.El-Khamisy.Cell Reports.2018(11)

[2]Mechanisms of Deubiquitinase Specificity and Regulation[J].Tycho E.T.Mevissen,David Komander.Annual Review of Biochemistry.2017

[3]Systematic and Quantitative Assessment of Hydrogen Peroxide Reactivity With Cysteines Across Human Proteomes[J].Ling Fu,Keke Liu,Mingan Sun,Caiping Tian,Rui Sun,Carlos Morales Betanzos,Keri A.Tallman,Ned A.Porter,Yong Yang,Dianjing Guo,Daniel C.Liebler,Jing Yang.Molecular&Cellular Proteomics.2017(10)

[4]Ubiquitin C-terminal hydrolase-L3 promotes interferon antiviral activity by stabilizing type I-interferon receptor[J].Peng Zhao,Tingting Guo,Liping Qian,Xiaofang Wang,Yukang Yuan,Qiao Cheng,Yibo Zuo,Jin Liu,Ying Miao,Qian Feng,Liting Zhang,Shuhua Wu,Hui Zheng.Antiviral Research.2017

[5]丁珊.K27链接二泛素及其识别蛋白UCHL3的结构生物学研究[D].中国农业科学院,2019.