抗生素检定培养基4号的应用

背景^[1-3]

抗生素检定培养基4号用于两性霉素B等的效价测定。成分(g/L)：蛋白胨10.0；氯化钠10.0；葡萄糖10.0；琼脂20.0；枸橼酸钠10.0；pH值6.1±0.1，25℃培养。

用法：称取本品60.0g,加热溶解于1000ml纯化水中,分装,115℃高压灭菌30分钟,备用。

抗生素检定培养基4号

两性霉素B（Amphotericin B），为多烯类抗真菌药物。两性霉素B对本品敏感的真菌有新型隐球菌、皮炎芽生菌、组织胞浆菌、球孢子菌属、孢子丝菌属、念珠菌属等，部分曲菌属对本品耐药；皮肤和毛发癣菌则大多耐药。两性霉素B对细菌、立克次体、病毒等无抗微生物活性。

两性霉素B可与敏感真菌细胞膜上的甾醇结合，损伤膜的通透性，导致细胞内重要物质如钾离子、核苷酸和氨基酸等外漏，从而破坏了细胞的正常代谢而抑制其生长。通常临床治疗所达到的药物浓度对真菌为抑菌作用，如药物浓度达到人体可耐受范围的高限时则对真菌起杀菌作用。

两性霉素B适用于下列真菌感染的治疗：隐球菌病、北美芽生菌病、播散性念珠菌病、球孢子菌病、组织胞浆菌病，由毛霉菌、酒曲菌属、犁头霉菌属、内胞霉属和蛙粪霉属等所致的毛霉菌病，由申克孢子丝菌引起的孢子丝菌病，由烟曲菌所致的曲菌病等。

应用^[4][5]

用于结节链霉菌发酵生产两性霉素B的工艺优化研究

鉴于两性霉素B发酵属于部分生长偶联型,提出分阶段调控策略,研究了分阶段p H、温度及溶氧控制策略对发酵产Am B的影响,发现分阶段p H 7.0,温度30℃/26℃和DO 20%控制策略为调控策略,在这三种策略下,Am B产量最终由分批发酵时的9.89 g/L分别提升到12.66 g/L,11.79 g/L和11.28 g/L,并通过胞外有机酸分析阐明在合成Am B时,不同调控策略对菌体代谢过程的影响,进一步说明结合代谢控制的发酵调控策略对两性霉素B生物合成的整个过程起决定性作用。

基于摇瓶添加物研究,在5 L发酵罐进行添加物补加放大实验,证明了在5 L发酵罐中同时添加上述四种化合物的有效性,Am B产量为12.56 g/L,可提高27.0%左右,副产物Am A含量为2.3%,下降24.8%,推测原因可能是Amph C PKS模块5中的烯酰还原酶结构域催化活性降低导致Am A合成受到抑制;

对5 L发酵罐补料调控方式进行优化,包括脉冲补料、p H-Stat及DO-Stat补料、恒速补料、变速补料及恒定残余葡萄糖浓度补料等6种补料方式,最终确定1.5 g/（L·h）流速下的恒速补料是补料策略,此时最高Am B产量达到15.79 g/L,较分批发酵提高59.7%,但副产物Am A含量从3.1%增加到7.1%;考虑到补料培养基成分较单一,对补料培养基进行优化,确定补料培养基为200 g/L葡萄糖,5 g/L蛋白胨和0.3 g/L硫酸铵。

基于前期实验研究,为最有效提高Am B产量并降低副产物Am A含量,进行联合调控策略下的分批补料发酵,即同时采用分阶段p H、温度及DO控制策略,并在发酵24 h时补加4 mg/L异丙醇、89 mg/L丙氨酸,1 g/L丙酮酸和25 mg/L烟酰胺四种添加物,以1.5 g/（L·h）的流速进行恒速补料,Am B产量最终达到18.39 g/L,较分批发酵提高85.9%,菌体量（PMV）达到45.0%,副产物Am A含量为2.1%,较分批发酵显著降低32.8%;通过胞外有机酸的检测,α-酮戊二酸,丙酮酸和柠檬酸浓度的变化被确定为最关键的代谢物节点,从而进一步阐明了该发酵调控策略下可能的代谢机制。

参考文献

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[3]Chitosan functionalized poly（ε-caprolactone）nanoparticles for amphotericin B delivery[J].Rossana Gabriela Vásquez Marcano,Tania Toyomi Tominaga,Najeh Maissar Khalil,Lígia Santos Pedroso,Rubiana Mara Mainardes.Carbohydrate Polymers.2018

[4]Improvement of amphotericin B production by a newly isolated Streptomyces nodosus mutant[J].Bo Zhang,Hai‐Dong Zhang,Yi‐Teng Zhou,Kai Huang,Zhi‐Qiang Liu,Yu‐Guo Zheng.Biotechnology and Applied Biochemistry.2018(2)

[5]张雨函.结节链霉菌发酵生产两性霉素B的工艺优化[D].浙江工业大学,2020.