支原体肉汤培养基的应用

背景^[1-3]

支原体肉汤培养基用于生物制品无菌试验支原体检测。

成分g/L：猪胃消化液：500mL；牛肉浸液(1:2)：500mL；酵母浸粉：5.0；氯化钠：2.5；葡萄糖：5.0；酚红：0.02，最终pH7.6±0.2。

用法：取本品21g，加1L蒸馏水，加热溶解，分装，121℃高压灭菌15min。用前加入20%小牛血清及抑菌剂。

支原体肉汤培养基

支原体（mycoplasma）是一类没有细胞壁、高度多形性、能通过滤菌器、可用人工培养基培养增殖的最小原核细胞型微生物，大小为0.1～0.3微米。由于能形成丝状与分枝形状，故称为支原体。支原体广泛存在于人和动物体内，大多不致病，对人致病的支原体主要有肺炎支原体、溶脲脲原体、人型支原体、生殖器支原体等。巨噬细胞、lgG及IgM对支原体均有一定的杀伤作用。

支原体革兰染色为阴性，但不易着色，一般用Giemsa染色，染成淡紫色。支原体主要以二分裂方式繁殖，亦可以出芽方式繁殖，分枝形成丝状后断裂呈球杆状颗粒。大部分支原体繁殖速度比细菌慢，适宜生长温度为35℃，最适pH值为7.8～8.0。在固体培养基上培养，形成典型的“荷包蛋”状菌落。支原体抵抗力较弱，对热、干燥敏感，对75%乙醇、煤酚皂溶液敏感，对红霉素、四环素、螺旋霉素、链霉素、卡那霉素等药物敏感，但对青霉素类的抗生素不敏感。

应用^[4][5]

用于牛支原体PCR检测方法的建立及临床应用研究

牛支原体（Mycoplasma bovis）主要引起牛的肺炎、关节炎、乳房炎、角膜炎、结膜炎等。

采集病牛的肺脏、肝、胸腔渗出物等,接种支原体肉汤培养基,同时剪碎病料呈小块状或直接接取胸腔渗出液,在20%马血清琼脂培养基上划线接种,置5%CO2、37℃温箱中培养,5～7d观察判定。

肉汤培养基中生长初期呈轻微浑浊或呈白色点状、丝状生长,以后逐渐均匀浑浊,半透明稍带乳光,不产生菌膜或沉淀,也无颗粒悬浮。

在20%马血清琼脂培养基上生长迟缓,为极小的水滴状圆形略带灰色的微细菌落,中央有乳头状突起。姬姆萨染色,显微镜观察,菌落为多形态,以球点状最常见,大小在125～250 nm。对病牛肺部实变组织进行DNA模板的提取,并分别以牛支原体、无乳支原体、丝状支原体等为阳性对照,利用支原体通用引物扩增其16SrRNA,建立了扩增16S rRNA序列进行支原体检测的方法,扩增到16S rRNA的基因片段,大小为1.5kb左右,经过测序,并与GenBank公布的支原体16S rRNA基因序列进行比较,分别与几种支原体阳性样本的序列同源性均在97100%。

支原体的培养困难,生长周期长,营养条件苛刻,使其不能作为早期、快速的检测方法。PCR技术为DNA体外扩增技术,呈2n放大效应,可检测样品中微量级的DNA,具有高灵敏性,因此适于早期检测。

对导致牛支原体病的丝状支原体丝状亚种、牛支原体、无乳支原体和绵羊肺炎支原体设计了4对特异引物,建立了多重PCR方法,以期达到快速检测的目的,试验具有特异性强,敏感性高的特点,为临床检测提供了强有力的技术支持,为临床疑似支原体感染病例的鉴别诊断提供较有效的快速诊断方法。

参考文献

[1]Mastitis in a 7-week old calf caused by Mycoplasma bovigenitalium[J].J.-P.Roy,D.Francoz,O.Labrecque.The Veterinary Journal.2007(3)

[2]The use of real-time PCR in the diagnosis and monitoring of Mycoplasma haemofelis copy number in a naturally infected cat[J].J.A.Braddock,S.Tasker,R.Malik.Journal of Feline Medicine and Surgery.2004(3)

[3]Development and Performance of a Microwell-Plate-Based Polymerase Chain Reaction Assay for Mycoplasma genitalium[J].Susan M.Dutro,Jennifer K.Hebb,Cresley A.Garin,James P.Hughes,George E.Kenny,Patricia A.Totten.Sexually Transmitted Diseases.2003(10)

[4]Surrogate marker for predicting the virus binding of urogenital cancer cells during adenovirus-based gene therapy[J].Yun-Jun Lai,Rey-Chen Pong,John D.McConnell,Jer-Tsong Hsieh.BioTechniques.2003(1)

[5]李彦芹.牛支原体PCR检测方法的建立及临床应用[D].山东农业大学,2009.