PCR纯化试剂盒的应用

背景^[1-3]

PCR纯化试剂盒采用便捷离心柱形式的专有硅胶膜技术，无需使用昂贵的树脂或有毒的苯酚-氯仿提取。它可有效去除PCR和其他反应混合物中的引物、dNTP、未掺入的标记核苷酸、酶和盐。该试剂盒可用于纯化25 bp至20 kb的DNA片段，回收率高达100%。每个纯化柱的总结合能力高达25µg DNA，全过程只需5分钟。纯化得到的DNA可用于常见下游应用，包括测序、限制性酶切、标记、连接、克隆、体外转录、印迹或原位杂交等。

PCR纯化DNA胶图

操作步骤：

1、在PCR反应液中直接加入5倍体积的PB液，颠倒混匀后，全部加入到吸附柱CA2中，10000g离心30-60秒，到掉收集管中的废液，将吸附柱CA2重新放入收集管中。

2、向吸附柱CA2中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，10000g离心30-60秒，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。

3、向吸附柱CA2中加入500μl漂洗液PW，10000g离心30-60秒，倒掉废液。

4、将离心吸附柱CA2放回收集管中，10000g离心2分钟，尽量除去漂洗液。

5、将吸附柱放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟。10000g离心2分钟收集DNA溶液。

应用^[4][5]

用于rhIL-24、EGCG对肺癌生长和肿瘤血管生成抑制的基础研究

构建新的pET-21a-IL-24重组质粒表达系统,并在大肠杆菌中获得稳定的高效表达,将表达产物纯化、复性后得到部分纯化人重组白细胞介素24（rhIL-24）蛋白。

检测其刺激外周血单个核细胞（PBMC）分泌细胞因子的生物学活性,观察其在体内外对肺癌细胞生长的抑制效应、凋亡效应以及抗肿瘤血管生成作用。为原核表达IL-24蛋白重组药物的研制奠定实验基础。茶多酚主要成分EGCG也具有高效无毒的抗肿瘤特性,实验择其与IL-24进行比照研究。

方法:以pBV220-IL-24载体为模板,以上游含有BamHI酶切位点,下游含有XhoI酶切位点的hIL-24引物进行PCR扩增,将pET-21a（+）质粒和PCR产物双酶切后用胶回收试剂盒回收目的片段,再连接过夜,转化DH5α感受态细胞,PCR鉴定重组子后测序。

将测序正确的pET-21a（+）-IL-24重组质粒抽提后转化BL21菌株,挑取阳性克隆。振荡培养过夜。接种LA培养基,摇菌至OD600≈0.40.6时,加入IPTG,经诱导不同时间（2、3、4、5小时）后,分别取样。

离心取菌体,超声破碎,将包涵体进行洗涤,溶包,复性后透析,获得部分纯化rhIL-24蛋白,Western-blotting方法对其进行鉴定。用ELISA法检测rhIL-24蛋白刺激PBMC分泌IL-6、IFN-γ和TNF-α的活性。

用MTT法评价rhIL-24、EGCG对A549肺癌细胞生长的影响,绘制细胞生长曲线,获得rhIL-24和EGCG的半数细胞抑制所需药物浓度值（IC50）。

通过FCM检测rhIL-24和EGCG对A549肺癌细胞生长周期和凋亡的影响。观察rhIL-24和EGCG对鸡胚尿囊膜（CAM）微血管生成的影响。

在建立的人肺癌裸鼠移植瘤模型上观察rhIL-24和EGCG对瘤体生长的抑制作用,用免疫组化法检测肿瘤组织中CD34和NF-κB的表达。

参考文献

[1]Increased expression of nuclear factor-κB/RelA is correlated with tumor angiogenesis in human colorectal cancer[J].Hong-Gang Yu,Xia Zhong,Yan-Ning Yang,He-Sheng Luo,Jie-Ping Yu,Juris J.Meier,Henning Schrader,Andreas Bastian,Wolfgang E.Schmidt,Frank Schmitz.International Journal of Colorectal Disease.2003(1)

[2]Inhibition of NF-κB Activity Decreases the VEGF mRNA Expression in MDA-MB-231 Breast Cancer Cells[J].Arihiro Shibata,Takashi Nagaya,Tsuneo Imai,Hiroomi Funahashi,Akimasa Nakao,Hisao Seo.Breast Cancer Research and Treatment.2002(3)

[3]A brassinosteroid transcriptional network revealed by genome‐wide identification of BESI target genes in Arabidopsis thaliana[J].XiaofeiYu,LeiLi,JaroslawZola,ManeeshaAluru,HuaxunYe,AndrewFoudree,HongqingGuo,SarahAnderson,SrinivasAluru,PengLiu,SteveRodermel,YanhaiYin.The Plant Journal.2011(4)

[4]Integration of Light-and Brassinosteroid-Signaling Pathways by a GATA Transcription Factor in Arabidopsis[J].Xiao-Min Luo,Wen-Hui Lin,Shengwei Zhu,Jia-Ying Zhu,Yu Sun,Xi-Ying Fan,Menglin Cheng,Yaqi Hao,Eunkyoo Oh,Miaomiao Tian,Lijing Liu,Ming Zhang,Qi Xie,Kang Chong,Zhi-Yong Wang.Developmental Cell.2010(6)

[5]朱晔涵.rhIL-24、EGCG对肺癌生长和肿瘤血管生成抑制的基础研究[D].苏州大学,2005.