LOUCY人淋巴细胞白血病悬浮细胞系的应用

背景^[1-3]

LOUCY人淋巴细胞白血病悬浮细胞系是Jurkat-FHCRC细胞株(Jurkat细胞株的衍生)的一个克隆。 Jurkat细胞株来源于一个14岁男孩的外周血。 经佛波酯和外源凝集素或抗T3单克隆抗体(两种类型的诱导都需要)诱导后可产生大量IL-2。

LOUCY人淋巴细胞白血病悬浮细胞系

细胞培养步骤

培养基及培养冻存条件准备：

1） 准备RPMI-1640培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2） 培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3） 冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

细胞处理：

1） 复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）补加到6ml。第二天换液并检查细胞密度。

2） 细胞传代

1）收到细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中，建议冻存一支备用，后续传代根据实际情况按1:2到1:5的比例进行。换液可通过添加几毫升新鲜培养基或离心之后去上清液，添加新培养基重悬培养。

应用^[4][5]

用于白血病来源LSCs和CD4+T淋巴细胞对BM-MSCs生物学特性的影响及其机制研究

将B-ALL细胞系Nalm-6来源的LSCs与BM-MSCs共培养,评估LSCs对BM-MSCs的免疫表型和造血因子和差异基因表达的影响及其机制研究；研究AML患者CD4+T淋巴细胞对BM-MSCs增殖的影响及其机制研究。

方法：1. B-ALL细胞系Nalm-6来源的LSCs对BM-MSCs生物特性的影响及其机制研究

1.收集妊娠15-22周健康胎儿四肢进行骨髓样本采集和获取BM-MSCs,通过组织块培养法培养,光学显微镜和扫描电子显微镜观察BM-MSCs形态,流式细胞仪检测BM-MSCs免疫表型CD29,CD31,CD34,CD44,CD45,CD73,CD90和CD105的表达。

2.使用CD34免疫磁珠分离柱从Nalm-6细胞分离CD34+细胞,定义为LSCs,与BM-MSCs共培养24h-72h,流式细胞仪检测BM-MSCs细胞免疫表型,Real-time PCR方法检测BM-MSCs造血细胞调节因子SDF-1、IL-6、IL-10、G-CSF、IL-3、IL-7、SCF、IL-11、IL-1α、IL-1p和LIF转录水平的表达。

3.LSCs与BM-MSCs共培养24h-72h后,采用Illumina Genome Analyzer/Hiseq2000分析BM-MSCs差异表达基因。根据RNA-Seq检测结果,使用real-time PCR对表达差异的基因进行验证。

4.构建lumican过表达载体pcDNA3.1-LUM/合成lumican干扰病毒siRNA-LUM（包括siRNA437和siRNA467）,使用Lipofectamine2000将pcDNA3.1-LUM质粒和siRNA-LUM载体转染进BM-MSCs中, western blot验证转染后细胞lumican蛋白的表达。

5. BM-MSCs转染pcDNA3.1-LUM或siRNA-LUM建立lumican过表达或者抑制细胞表达系,再与Nalm-6细胞共培养,流式细胞仪检测Nalm-6细胞的细胞周期、Annexin V/PI双染法结合流式细胞仪检测Nalm-6细胞凋亡、CCK-8法检测Nalm-6细胞对VP-16的敏感性。

参考文献

[1]The cytokine-mediated crosstalk between primary human acute myeloid cells and mesenchymal stem cells alters the local cytokine network and the global gene expression profile of the mesenchymal cells[J] . H?kon Reikvam,Annette K. Brenner,Karen Marie Hagen,Knut Liseth,Silje Skrede,Kimberley Joanne Hatfield,?ystein Bruserud.  Stem Cell Research . 2015 (3)

[2]IL-10 gene polymorphism and influence of chemotherapy on cytokine plasma levels in childhood acute lymphoblastic leukemia patients[J] . Carlos Hiroji Hiroki,Marla Karine Amarante,Diego Lima Petenuci,Alberto Yoichi Sakaguchi,Fausto Celso Trigo,Maria Angelica Ehara Watanabe,Carlos Eduardo Coral de Oliveira.  Blood Cells, Molecules and Diseases . 2015 (2)

[3]A CXCR4 antagonist leads to tumor suppression by activation of immunecells in a leukemia-induced microenvironment[J] . A-Reum Han,Ji Lee,Hee-Je Kim,Woo-Sung Min,Gyeongsin Park,Se-Hoon Kim.  Oncology Reports . 2015 (6)

[4]The inherent metastasis of leukaemia and its exploitation by sonodynamic therapy[J] . Matthew Trendowski.  Critical Reviews in Oncology / Hematology . 2015 (2)

[5]于臻. 白血病来源LSCs和CD4~+T淋巴细胞对BM-MSCs生物学特性的影响及其机制研究[D].山东大学,2016.