快速DNA产物纯化试剂盒的应用

背景^[1-3]

快速DNA产物纯化试剂盒采用新型硅基质膜技术和试剂配方，通过离心吸附柱快速简单的结合-洗涤-洗脱三步即可从PCR产物或酶反应液(酶切，连接，探针标记等)中纯化回收100 bp-10 kb的DNA片段，每个吸附柱最高可吸附10μg的DNA，同时限度的去除引物、寡核苷酸、酶等杂质。纯化回收的DNA纯度及浓度高，完整性好，回收率高，可直接用于测序、连接和转化、标记、体外转录等分子生物学实验。

DNA产物纯化胶图

操作步骤：

1、估计DNA反应液的体积，加入5倍体积的Buffer PB，充分混匀(无需去除石蜡油或矿物油)。

注意：

1)如DNA反应体系为50μl(不包括石蜡油体积)，则加入250μl Buffer PB。

2)在加入Buffer PB后检测溶液的pH值，若pH值＞7.5，可向其中加入10-30μl的3 M醋酸钠(pH5.0)，从而将pH值调到5-7。

2、柱平衡：向已装入收集管中的吸附柱DM中加入200μl Buffer PS，13000rpm(~～～16200×g)离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

3、将步骤1中所得溶液加入到已装入收集管的吸附柱中，室温放置1分钟，13000rpm离心30-60 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

注意：吸附柱容积为750μl，若样品体积大于750μl可分批加入。

4、向吸附柱中加入500μl Buffer PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)13000rpm离心30-60 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

注意：如果纯化的DNA用于盐敏感实验(例如平末端连接实验或直接测序)，建议加入Buffer PW后静置2-5分钟再离心。

5、13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。

注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的乙醇。

6、将吸附柱放到一个新离心管(自备)中，向吸附膜中间位置悬空滴加30-50μl Buffer EB，室温放置1分钟。13000rpm离心1分钟，收集DNA溶液。-20℃保存DNA。

应用^[4][5]

用于绿脓杆菌噬菌体PaP1 DNA聚合酶通过DNA损伤的动力学机制研究

构建、表达和纯化没有外切酶活性的绿脓杆菌噬菌体PaP1的DNA聚合酶,在分子层面上研究其进行DNA复制以及跨DNA损伤复制的动力学机制,有助于噬菌体药物的研发以及指导合理用药。

方法:（1）构建、表达和纯化没有外切酶活性的gp90。本课题组前期已经发现噬菌体PaP1 DNA聚合酶gp90具有单链DNA和双链DNA外切酶活性。进行体外动力学实验,为了排除对错配切除的影响,仅仅研究聚合酶本征的性质,需要去除外切酶活性。首先构建质粒,其可以表达消除外切酶的DNA聚合酶突变体,然后用IPTG诱导表达,利用镍柱纯化带有组氨酸标签的gp90及其突变体。

（2）DNA聚合酶参与DNA复制以及通过8-oxoG损伤的动力学机制研究。通过稳态动力学方法,研究全长延伸、单个核苷酸插入和下一位碱基延伸中8-oxoG对DNA复制效率和保真度的影响;采用稳态前动力学方法研究DNA复制通过8-oxoG损伤时单点插入效率;采用生物物理相互作用研究方法,研究8-oxoG对DNA聚合酶与DNA相互作用的影响。

（3）DNA聚合酶通过O6-MeG的动力学机制研究。通过稳态动力学方法,研究全长延伸、单个核苷酸插入以及下一位碱基延伸中O6-MeG对DNA复制效率和保真度的影响;利用稳态前动力学方法,研究单个核苷酸插入的效率;采用生物物理相互作用研究方法,研究O6-MeG对聚合酶和DNA相互作用的影响;采用stopped-flow Auto SF-120快速荧光动力学方法研究O6-MeG对聚合酶构象改变的影响机制。

参考文献

[1]Kinetic analysis of bypass of 7,8-dihydro-8-oxo-2′-deoxyguanosine by the catalytic core of yeast DNA polymeraseη[J].Qizhen Xue,Mengyu Zhong,Binyan Liu,Yong Tang,Zeliang Wei,F.Peter Guengerich,Huidong Zhang.Biochimie.2016

[2]Kinetic analysis of bypass of abasic site by the catalytic core of yeast DNA polymerase eta[J].Juntang Yang,Rong Wang,Binyan Liu,Qizhen Xue,Mengyu Zhong,Hao Zeng,Huidong Zhang.Mutation Research-Fundamental and Molecular Mec.2015

[3]Modern Therapeutic Approaches Against Pseudomonas aeruginosa Infections[J].Agata Dorotkiewicz-Jach,Daria Augustyniak,Tomasz Olszak,Zuzanna Drulis-Kawa.Current Medicinal Chemistry.2015(14)

[4]Antimicrobial susceptibility of Gram-negative organisms isolated from patients hospitalized in intensive care units in United States and European hospitals（2009–2011）[J].Helio S.Sader,David J.Farrell,Robert K.Flamm,Ronald N.Jones.Diagnostic Microbiology&Infectious Disease.2013

[5]顾仕苓.绿脓杆菌噬菌体PaP1 DNA聚合酶通过DNA损伤的动力学机制研究[D].重庆理工大学,2017.