糖原PAS过碘酸雪夫染色试剂盒的应用

背景^[1-3]

糖原PAS过碘酸雪夫染色试剂盒即PAS染色试剂盒，也称糖原PAS染色液试剂盒(Glycogen Periodic Acid-Schiff Staining Kit)，是一种使用过碘酸、雪夫(Schiff)试剂对组织中糖原、粘多糖及真菌等进行染色的试剂盒。本试剂盒适用于不同组织的石蜡切片或冰冻切片、培养的细胞、血涂片、骨髓涂片等样品。

过碘酸-雪夫染色，即PAS染色，因其主要用于多糖(polysaccharides)如糖原(glycogen)和粘性物质(mucosubstances)如黏多糖(glycosaminoglycan)、黏蛋白(mucins)、糖蛋白(glycoproteins)和糖脂(glycolipids)等物质的染色，所以也称糖原染色(Glycogen Staining)。

糖原PAS过碘酸雪夫染色细胞

过碘酸-雪夫染色是病理学中常规的染色方法之一，McManus在1946年最先使用过碘酸-雪夫技术显示黏蛋白，该染色法不仅能够显示糖原还能显示中性粘液性物质和某些酸性物质以及软骨、垂体、真菌、色素、淀粉样物质、基底膜等。另外，临床诊疗中PAS染色常用于辅助淋巴细胞性白血病的诊断。

糖原是由D-葡萄糖的分支或直链组成的高分子多糖类化合物，糖原的合成与分解代谢主要发生在肝、肾和肌肉组织中。过碘酸是一种强氧化剂，能将组织或者细胞中的糖原及有关物质中的1,2-乙二醇基(CHOH-CHOH)氧化成两个游离醛基(-CHO)，且过碘酸的特点是不再继续将醛基氧化成羧基。

Schiff试剂(Schiff reagent)，又称品红亚硫酸试剂，含碱性品红和亚硫酸，碱性品红与亚硫酸结合后，失去醌式结构而生成无色品红。无色品红与过碘酸氧化的游离醛基结合，醌式结构恢复，生成洋红色(magenta)产物，定位于胞浆，颜色深浅与多糖含量成正比。

应用^[4][5]

用于磺脲类药物胰腺外作用研究及机制探讨研究

明确大鼠SUR1基因敲除后其糖代谢的改变及特点;探索大鼠SUR1敲除后糖代谢改变的可能机制。

方法1、SUR1敲基因大鼠的构建培养及分组在Entrez Gene数据库中查询SUR1基因ID（25559）。以Sprague-Dawley大鼠为背景,运用TALEN靶向敲除技术构建SUR1敲除大鼠,并运用基因测序及Western blot技术鉴定SUR1基因成功敲除。分组:4周龄,体重90-140g的大鼠随机分为:SUS现1-/-雄性大鼠;SUR1-/-雌性大鼠;野生型（wild-type,WT）雄性大鼠;WT雌性大鼠四组,每组6只。标准饲料喂养8周。

2、体重和血糖测定在8周试验期间,每周测定大鼠体重,并在禁食12小时后采集尾静脉血测定空腹血糖。

3、葡萄糖耐量（IPGTT）和胰岛素耐量（IPITT）测定分别在大鼠4周龄、8周龄和12周龄行IPGTT和IPITT检测,评估各组大鼠葡萄糖耐量及胰岛素抵抗情况。IPGTT:各组大鼠,禁食12小时,给予1克每千克体重的葡萄糖腹腔注射,并分别于注射后的0、15、30、60及120分钟测尾静脉血糖并记录,绘制各组每只大鼠时间-血糖曲线,得到曲线下的面积（areas under curve,AUC）并计算每组AUC均值。IPITT:各组大鼠禁食4小时后给予1个单位每千克体重的胰岛素腹腔注射,血糖测定、时间-血糖曲线绘制及平均AUC计算同IPGTT。

4、标本留取:试验结束后,将大鼠麻醉,心脏灌注后快速取肝脏、肌肉及胰腺等组织,取材后将组织分为三部分:一部分组织用冷冻切片包埋剂固定;一部分组织固定于4%多聚甲醛中,24小时后脱水并石蜡包埋;其余组织放于液氮快速冰冻后转移至-80℃冰箱保存。

5、组织病理学及免疫荧光染色检测:胰腺:免疫荧光双染检测胰腺中胰岛素和胰高血糖素的表达。肝脏、肌肉:应用过碘酸-雪夫染色（Periodic Acid-Schiff,PAS staining）方法检测肝脏、肌肉石蜡切片中糖原储存。肌肉:免疫荧光染色检测肌肉中葡萄糖转运体4（GLUT4）的表达。

6、蛋白免疫印迹检测（Western blotting test）将肝脏、肌肉组织从超低温冰箱取出,裂解液研磨提组织蛋白,应用GSK3、p-GSK3、GLUT4等与葡萄糖代谢密切相关的指标的抗体测定其在每组大鼠肝脏、肌肉中的表达量,以此评估其激活水平的变化。

参考文献

[1]Disruption of Sur2-containing K（ATP）channels enhances insulin-stimulated glucose uptake in skeletal muscle.Chutkow WA,Samuel V,Hansen PA,et al.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.2001

[2]Mechanisms by which glucose can control insulin release independently from its action on adenosine triphosphate-sensitive K+channels in mouse B-cells.Gembal M,Detimary P,Gilon P,Gao ZY,Henquin JC.The Journal of Clinical Investigation.1993

[3]The acute and chronic effects of sulfonylurea therapy in type II diabetic subjects.Kolterman O G,Gray R S,Shapiro G,Scarlett J A,Griffin J,Olefsky J M.Diabetes.1984

[4]Stimulation of glucose uptake and increased plasma membrane content of glucose transporters in L6 skeletal muscle cells by the sulfonylureas gliclazide and glyburide.Tsiani E,Ramlal T,Leiter L A,Klip A,Fantus I G.The Journal of Endocrinology.1995

[5]张瑞.磺脲类药物胰腺外作用研究及机制探讨[D].山东大学,2019.