快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的应用

背景^[1-3]

快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒采用新型硅基质膜技术和试剂配方,通过独特的离心吸附柱快速的结合DNA-洗涤-洗脱步骤即可从普通或低熔点琼脂糖凝胶中回收纯化70 bp-10 kb的DNA片段,溶胶速度快,每个吸附柱可吸附10μg的DNA,同时有效去除引物、核苷酸、酶、矿物油、琼脂糖等杂质。

纯化回收的DNA纯度及浓度高,完整性好,回收率高,可直接用于测序、连接和转化、标记、体外转录等分子生物学实验。

快速琼脂糖凝胶DNA回收胶图

操作步骤:

1、琼脂糖凝胶电泳后，将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分），放入干净的离心管中，称取重量。

2、向胶块中加入3倍体积溶胶液（如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100ul,则加入300ul溶胶液），50-55℃水浴放置10min，期间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

3、将上一步所得溶液加入一个吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。

4、向吸附柱中加入600ul漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

5、向吸附柱中加入600ul漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

6、12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，防止漂洗液中的乙醇影响后续的实验。

7、将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加适量经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置2min，12000rpm离心1min。

8、DNA产物-20℃保存。

应用^[4][5]

用于类病毒cDNA体外连接产物回收中出现的非特异条带原因探究研究

通过琼脂糖凝胶电泳分析和回收啤酒花矮化类病毒（Hop Stunt viroid,HSVd）cDNA体外连接产物中二聚体时,常发现回收的二聚体产物中有单倍体和其他非目标条带存在,这种现象目前尚未报道,为了明确该现象发生的原因,本研究开展了相关实验。

结果如下:1.分别通过PCR扩增和体外连接获得HSVd cDNA单倍体、二倍体及二倍体以上的多聚体片段混合产物样品,通过琼脂糖凝胶电泳回收其中的二聚体,回收产物再经过聚丙烯酰铵凝胶（Polyacrylamide acrylamide gel,PAGE）电泳,结果显示,除了二聚体外,从两种产物中还回收到了单倍体和其他非目标条带。

2. 通过体外连接,获得桃潜隐花叶类病毒（Peach latent mosaic viroid,PLMVd）三个分离物和真菌TP-3-1延伸因子的单倍体、二倍体及二倍体以上的多聚体片段混合产物样品,然后通过琼脂糖凝胶电泳回收其二聚体,结果显示,对4个样品回收的二聚体产物中均存在单倍体和其他非目标条带。结果表明这种现象不仅存在HSVd的cDNA中,而且也存在于其他类型的DNA中,是一种普遍现象。

3. 选取通过PCR获得的HSVd cDNA单倍体、二倍体及二倍体以上的多聚体片段混合产物,使用4种不同品牌的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收其二聚体,回收产物经PAGE电泳,结果显示回收产物中除二聚体外均有单倍体和非目标条带,表明这种非特异反应与选用的胶回收试剂盒品牌无关。

参考文献

[1]A rapid and efficient procedure for the purification of DNA from agarose gels.S.C.Girvitz,S.Bacchetti,A.J.Rainbow,F.L.Graham.Analytical Biochemistry.1980

[2]Activation and Repression at the Escherichia coli ynfEFGHI Operon Promoter.Meng Xu,Stephen J.W.Busby,Douglas F.Browning.Journal of Bacteriology.2009

[3]Fangman W L.Nucleic Acids Research.1978

[4]A reliable method for the recovery of DNA fragments from agarose and acrylamide gels.Dretzen G,Bellard M,Sassone-Corsi P,et al.Analytical Biochemistry.1981

[5]刘森.类病毒cDNA体外连接产物回收中出现的非特异条带原因探究[D].华中农业大学,2016.